不同品种箬竹叶生化成分及抗氧化能力分析

张亚兰，赵建诚，杨振亚，石 瑞，李 琴，王衍彬，贺 亮, ，陈永健

（1.国家林业局竹笋工程技术研究中心，浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023；2.南京林业大学轻工与食品学院，江苏南京 210037；3.浙江圣氏生物科技有限公司，浙江湖州 313399）

箬竹（Indocalamus）为禾本科，箬竹属植物[1]，箬竹叶片的长、宽度适宜，并含有独特的香气，是千百年来我国端午节粽叶的主要来源。在很长一段时间里，箬竹叶作为粽叶仅为食材包装所使用，用后多被弃为厨余垃圾，很少有人考虑其功能性作用[1]。近几年，人们开始对竹叶的功能性进行研究，箬竹叶营养价值丰富，富含多种微量元素，功能性成分。包括竹叶中多种多样的化学物质和生理能力成分。

研究表明，竹叶提取物中含有大量的酚类、酯类、黄酮、氨基酸及多种微量元素，具有抗氧化能力、抗衰老能力[2]，并可以调节人体循环系统和生理功能，还有抗菌、抑菌等功能[3]，对人体有重要作用。因此，对竹叶醇提取物进行抗氧化能力研究是有依据，并有研究价值的。目前，除了对竹叶提取物的生理功能有大量研究外，也有研究人员对箬竹叶的各种功能性成分进行了提取及研究，包括氨基酸、粗蛋白、粗脂肪、灰分等营养成分[1]以及黄酮[4−5]、多糖[6−7]、矿质元素[8]、多酚[9]等功能性成分。但这些研究是单一的，而且并未对多种箬竹叶的功能性成分差异进行具体分析。因此，本研究对不同品种箬竹叶的生化成分含量和抗氧化能力差异进行了分析。

本研究主要以浙江省林业科学研究院内浙江竹种园的11种箬竹资源为对象，不同种箬竹叶的总黄酮、多糖、多酚、挥发油四种功能性成分含量及其抗氧化能力能力差异。先利用国家标准测量其营养成分，再分别用不同的提取方法提取粗产品，即水提（多糖）和醇提（总黄酮、多酚）。利用标准品制备标准曲线，拟合回归方程，求得其含量。其次对其竹叶醇提取物进行DPPH自由基、超氧阴离子及羟自由基清除率的比较。最后综合各方面比较11种样品的优劣。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

11种箬竹叶（矮箬竹、髯毛箬竹、阔叶箬竹、长节箬竹、美丽箬竹、长耳箬竹、泡箬竹、华箬竹、天目箬竹、胜利箬竹和米箬竹） 浙江省林业科学研究院竹类植物园；Al（NO3）3、芦丁、无水葡萄糖、NaNO2、苯酚、Na2CO3、ZnSO4、乙酸乙酯、邻苯三酚、FeSO4、没食子酸、DPPH、H2O2、正己烷、CH2Cl2分析纯，成都市科隆化学品有限公司；NaOH、浓硫酸 分析纯，杭州化学试剂有限公司（监制）；95%乙醇 分析纯，杭州汇普化工仪器有限公司；福林酚试剂、盐酸优级纯，国药集团化学试剂有限公司。

Sartorius BSA 224S型电子天平 赛多利斯Sartorius科学仪器有限公司；DFT-150多功能高速中药粉碎机 温州顶历医疗器械有限公司；真空冷冻干燥机 LABCONCO公司；heating Bath B-491水浴锅、Rotavapor R-210旋转蒸发仪 BUCHI公司；Centrifuge 5804R冷冻离心机 Eppendorf公司；超声波清洗机 南京赛飞生物科技有限公司；HITACHI U-1900紫外可见分光光度计 株式会社日立制作所；HH-2K4二列四孔型水浴锅 巩义市予华仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品来源及处理 采集的样品全部来源于浙江省林业科学研究院竹类植物园，采集矮箬竹、髯毛箬竹、阔叶箬竹、长节箬竹、美丽箬竹、长耳箬竹、泡箬竹、华箬竹、天目箬竹、胜利箬竹和米箬竹的竹叶，对其水含量进行测定过后，放置在室温下，自然风干。最后使用粉碎机粉碎，装至密封袋中干燥保存。在开始实验前再进行烘干处理，采用绝干样品进行实验，减少实验误差。

1.2.2 竹叶营养成分含量的测定 所有成分的含量检测均采用最近几年公布的国家标准。其中，粗蛋白含量测定采用GB 5009.5-2016中的凯氏定氮法；采用GB 5009.3-2016中的直接干燥法测定含水量；粗脂肪测定采用GB/T 14772-2008中的直接滴定法；参照GB 5009.4-2016的方法测定灰分含量。

1.2.3 功能性成分提取及测定

1.2.3.1 多糖提取及含量测定 多糖提取：综合文献[10−12]的方法，采用简单的水提法。将蒸馏水与11种样品分别以料液比1:20进行均匀混合，90 ℃水浴水提2 h。减压过滤，将滤渣丢弃，留下滤液，将其在60～70 ℃旋蒸仪上加热浓缩汁原体积至1/3后结束旋蒸，按体积比1:4加入95%乙醇进行沉淀24 h。将上清液（95%乙醇）倒去少许后分装至50 mL离心管，7500 r/min离心5 min。放入冷冻干燥机干燥24 h，得粗多糖。

多糖含量测定：多糖含量参考张倩茹等[13]的方法改进苯酚-硫酸法进行测定。制备100 μg/mL葡萄糖标准溶液，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL葡萄糖溶液置于20 mL具塞试管中，每支试管加蒸馏水补至2 mL，在通风橱中加入1 mL的5%苯酚溶液混匀，然后快速加入5 mL浓硫酸混匀。室温静置10 min，放入30 ℃水浴加热20 min。在490 nm下（使用上述空白试剂试管调节零点）测定吸光值ABS，以吸光值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，拟合标准曲线为y=12.354x−0.0032，R2=0.9994。称取11种黄酮样品各30 mg，将其溶解并定容10 mL。从每个样品溶液中吸取0.2 mL多糖待测液按照相同方法测定吸光度。

1.2.3.2 黄酮提取及含量测定 黄酮提取：参考文献[4,14]的方法通过适当调整进行醇提。将60%乙醇与11种样品分别以料液比1:30进行均匀混合，65℃水浴醇提2 h。减压过滤，保留滤液，将其60～65℃旋蒸浓缩至原体积1/4后分装至20 mL离心管，封上封口膜后放入−80℃冰箱冷冻2 h，最后放入冻干机48 h，得粗黄酮。

黄酮含量测定：参考相关文献[15−16]，采用Al（NO3）3络合分光光度法。分别取200 μg/mL芦丁标准溶液0、0.25、0.5、1、2、3、4、5 mL置于20 mL具塞试管中，加60%乙醇补至5 mL，加1 mL 50 g/L NaNO2溶液，室温静置5 min。加1.5 mL 100 g/L Al（NO3）3溶液，室温静置6 min。加4 mL 200 g/L NaOH溶液，室温静置10 min。在510 nm下，使用上述空白试剂试管调节零点，记录吸光值，以吸光值为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，制作标准曲线为y=4.9395x−0.0055，R2=0.9992。分别称取11种样品30 mg，溶解于20 mL具塞试管中，利用相同操作测定吸光度。

1.2.3.3 多酚提取及含量测定 多酚提取：参考文献[12,17−18]得出的最佳提取条件，采用超声波辅助醇提。将50%乙醇与11种样品分别以料液比1:15进行均匀混合，超声提取40 min。减压过滤，将滤饼丢弃，留下滤液即多酚待测液。向滤液加入沉淀剂Zn2+（硫酸锌:样品=0.5:1.6）来形成螯合物沉淀多酚，并使用7.5% NaCO3溶液调节pH6～6.5。沉淀完后，将溶液分装离心，留下沉淀，加入适量2 mol/L盐酸转溶，加入10 mL乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯层于梨形瓶中。将液体放在65 ℃旋蒸仪上减压蒸馏至浸膏状。将梨形瓶放入80 ℃干燥箱内干燥，得高纯度多酚。

多酚含量测定：采用Folin-Ciocalteu比色法[19]测定，制备0.234 mg/mL没食子酸标准溶液，分别取0、0.1、0.25、0.5、0.75、1 mL于20 mL具塞试管中，加蒸馏水至2 mL。加入0.5 mL福林酚试剂混匀，室温静置3 min。加入4 mL 7.5% NaCO3溶液，混匀后室温静置1 h。在744 nm下，使用上述空白试剂试管调节零点，测定吸光值ABS，以吸光值为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标，拟合标准曲线为y=57.875x+0.0076，R2=0.9997。称取11种多酚待测样30 mg左右于20 mL具塞试管中，按照相同的方法测定吸光度。

1.2.3.4 挥发油提取及含量测定 参考杨萍等[20]的方法，用同时蒸馏萃取法提取挥发油。分别取不同箬竹叶样品60 g，放入1 L的烧瓶中，以样品:蒸馏水=1:8加入蒸馏水，连接在同时蒸馏萃取装置左侧样品进样口。在250 mL蒸馏瓶中加入60 mL CH2Cl2，连接同时蒸馏萃取装置的右侧萃取剂进样口，65 ℃水浴加热左侧装有CH2Cl2的烧瓶，同时用电热套加热左侧装样品的烧瓶，提取8 h。将放置CH2Cl2的烧瓶取下，将中间出口收集装置中的CH2Cl2于此烧瓶中，使用45 ℃旋转蒸发仪将CH2Cl2蒸出，将挥发油避光4 ℃保存。挥发油含量（%）=挥发油的质量／箬竹叶样品的质量×100。

1.2.4 竹叶醇提取物 参考刘怡菲[21]的方法进行，采用超声波辅助乙醇浸提法获得不同品种箬竹叶醇提取物。准确称取11种箬竹叶各10 g于500 mL烧瓶中。加入30倍体积的60%乙醇溶液，45 ℃超声提取1.5 h，将浸提物进行真空抽滤，收集滤液。将滤液于55 ℃旋转蒸发仪去除大量乙醇后，得箬竹叶醇提取物，保存至4 ℃冰箱中，备用。

1.2.5 抗氧化能力测定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基清除率参照Zhang等[22−23]的方法，取DPPH样品用无水乙醇制备0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液于100 mL棕色容量瓶中，避光保存，用蒸馏水分别将11种箬竹叶醇提取物稀释成质量浓度为0.60 mg/mL，取2 mL样品溶液与3 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液于10 mL具塞试管中，混匀后避光反应1 h。在517 nm下测吸光值，使用无水乙醇调零。DPPH自由基清除率（%）=[1−（DPPH样品混合液的吸光值－样品本身的吸光值）／DPPH乙醇溶液吸光值]×100。

1.2.5.2 超氧阴离子清除能力 采用王紫薇等[24]的方法，将不同品种箬竹叶醇提取物用蒸馏水分别稀释为0.50 mg/mL醇提取物溶液，取1.0 mL的醇提取物溶液于10 mL具塞试管中，加入4 mL Tris-HCl缓冲液，室温反应20 min，加入0.3 mL 5 mmol/L邻苯三酚溶液，充分反应，在420 nm下测吸光值，用1 mL蒸馏水替代样品作为空白对照组。超氧阴离子清除率（%）=（1−样品混合液的吸光值／空白对照组的吸光值）×100。

1.2.5.3 羟自由基的清除能力 参考王紫薇等[24]的方法，将箬竹叶醇提取物用蒸馏水稀释成质量浓度为0.50 mg/mL醇提取物溶液，取1 mL醇提取物溶液于20 mL具塞试管中，加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4、1.5 mL磷酸盐缓冲液（pH=7.4）、1.5 mL 7.5 mmol/L水杨酸-乙醇溶液以及1 mL 0.01% H2O2溶液混匀，在37 ℃水浴中反应半小时。在510 nm下测吸光值，用1 mL蒸馏水替代样品作为空白对照组。计算公式如下：羟自由基清除率（%）=[1−（样品混合溶液吸光值−样品本身吸光值）／空白对照组吸光值）]×100。

1.3 数据处理

对实验数据通过Excel以及SPSS 19.0整理分析。不同品种的每个成分含量测3次，结果取3次测定值的平均值，用平均值±标准差（mean±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 不同品种箬竹叶营养成分含量差异

不同箬竹叶营养成分含量见表1，11种箬竹叶的水分含量在30%～40%之间，粗蛋白含量在20%左右，粗脂肪含量在5%左右，灰分在13%～16%之间。不同品种的营养成分含量差异大小，通过变异系数来体现，变异系数没有量纲，可以进行更为客观的比较[25]。同一地区不同品种的各营养成分含量存在显著差异（P<0.05），四种营养成分的变异系数，只有粗蛋白的为13.93%，其他三种变异系数不超过10%。不同箬竹叶的水分含量变异系数是6.96%，华箬竹的水分含量最高，达39.86%±0.20%；而矮箬竹的水分含量最低，仅31.67%±0.23%。不同箬竹叶粗蛋白含量的变异系数是13.93%，含量最高的是矮箬竹，有26.12%±0.41%；其次是米箬竹，含有24.72%±0.49%；而含量最低的是美丽箬竹，仅有16.68%±0.42%。不同箬竹叶粗脂肪含量的变异系数是7.53%，含量最高的是胜利箬竹，达到5.21%±0.06%；其次是阔叶箬竹含有5.18%±0.08%；而粗脂肪含量最低的是天目箬竹，仅有4.10%±0.07%。不同品种灰分含量的变异系数是4.87%，含量最高的是阔叶箬竹，含有15.17%±0.04%，其次是长节箬竹，含有15.06%±0.03%；而含量最低的是米箬竹，仅含有13.15%±0.02%。从表1可以看出，11种箬竹叶的四种基本营养成分中，水分、粗脂肪、灰分这三种成分的含量两两相较差异较小，粗蛋白含量的差异性较大。

表1 不同箬竹叶营养成分含量差异Table 1 Differences of nutrient contents in different Indocalamus leaves

2.2 不同品种箬竹叶功能性成分含量差异

不同箬竹叶功能性成分含量见表2，多酚含量波动最大，在0.17%～0.62%范围内；多糖含量在0.24%～0.69%之间，黄酮含量在0.25%～0.68%之间，也有较大变化幅度；挥发油含量在0.36%～0.64%之间，变化幅度较小。不同箬竹叶黄酮含量的变异系数为34.47%，长节箬竹的黄酮含量最高，为0.68%±0.07%，其次是阔叶箬竹有0.67%±0.06%；而黄酮含量最低的泡箬竹，仅有0.25%±0.03%。含量最高的比含量最低的高出不止3倍，可见其含量差异之大。11个品种中多糖含量最高的是髯毛箬竹，含有0.69%±0.04%；而含量最低的是米箬竹，仅有0.24%±0.02%。不同品种多糖含量的变异系数是28.03%。对于多酚含量的结果，其变异系数是38.04%，含量最高的是长节箬竹（0.62%±0.09%），其次是胜利箬竹有0.54%±0.06%；多酚含量最低的是米箬竹，仅有0.17%±0.01%。长节箬竹多酚含量是米箬竹的近4倍，差异明显。不同品种挥发油含量的变异系数是22.36%，含量最高的是阔叶箬竹，为0.64%±0.05%，其次是天目箬竹有0.59%±0.05%；挥发油含量最低的是胜利箬竹，仅有0.36%±0.03%。从表中结果也可以看出，同一地区不同品种四种功能性成分中箬竹叶挥发油含量的差异性并不大，相较而言，黄酮、多糖和多酚含量的差异就明显较大。

表2 不同箬竹叶功能性成分含量差异Table 2 Differences in contents of functional components in different Indocalamus leaves

2.3 不同品种箬竹叶抗氧化能力差异

表3表示了同一地区不同箬竹叶抗氧化能力的差异，箬竹叶醇提取物对DPPH自由基、超氧阴离子及羟自由基清除率可以表示抗氧化的能力。不同箬竹叶DPPH自由基清除率的范围为53.76%～65.07%，变异系数为5.70%，清除率最高的是长耳箬竹，达到65.07%±0.33%；此外，长节箬竹、胜利箬竹、天目箬竹都有较高的清除率，分别是63.02%±0.40%、63.44%±0.37%、62.16%±0.25%；清除率最低的是矮箬竹，为53.76%±0.27%。不同箬竹叶超氧阴离子清除率的范围是36.12%～47.26%，变异系数为7.86%，清除率最高的是天目箬竹，达47.26%±0.34%；其次是阔叶箬竹，达到45.40%±0.44%；最低的是泡箬竹，清除率为36.12%±0.30%。箬竹叶羟自由基清除率在62.01%～77.24%，变异系数为5.99%，清除率最高的是长节箬竹，达到77.24%±0.41%；其次是天目箬竹，达到75.93%±0.49%；最低的是米箬竹，清除率为62.01%±0.52%。11种品种中，DPPH自由基、超氧阴离子、羟自由基三种清除率的变异系数均不超过10%。相较于功能性成分含量差异，抗氧化能力的差异相对较小，变幅并不大。

表3 不同箬竹叶抗氧化能力差异Table 3 The difference in antioxidant activity of different Indocalamus leaves

2.4 不同箬竹叶权重分析及综合评分

2.4.1 抗氧化能力权重分析 为了方便进行最终的权重分析和综合评分，所以先将抗氧化能力归纳为一组数据。把DPPH自由基、超氧阴离子及羟自由基清除率，设为同等重要。每组数据的最大值作为1，最小值作为0，然后将所有数据归一化。由于重要程度相同，则公式为Y=Y1×1/3+Y2×1/3+Y3×1/3。

从最终的得值可以看出（表4），天目箬竹竹叶醇提取物的抗氧化能力最强，得分达0.8856；此外长节箬竹、长耳箬竹、髯毛箬竹的竹叶醇提取物的抗氧化能力相对较强，得分分别为0.7113、0.6182、0.5795；而矮箬竹的抗氧化能力最弱，仅得分0.0991。

表4 抗氧化能力数据归一化Table 4 Normalization of antioxidant activity data

2.4.2 功能性成分及抗氧化能力权重分析 诸多研究[23,26]可以看出，黄酮作为箬竹叶的主要功能性成分，重要性更高。因此，将黄酮含量的重要性设为最高，多糖含量、多酚含量及抗氧化能力次之，挥发油含量的重要性最低。由此，进行权重分析。

2.4.2.1 功能性成分数据归一化 将每组数据的最大值作为1，将所有数据归一化，见表5。

表5 功能性成分含量数据归一化Table 5 Normalization of functional ingredient content data

2.4.2.2 功能性成分、抗氧化能力权重分析及综合评分 使用AHP层次分析法[27−28]确定权重系数，根据箬竹叶功能性成分含量及抗氧化能力在之后工业上的应用，决定其重要程度。将黄酮含量设为重要，多糖含量、多酚含量及抗氧化能力设为比较重要，挥发油含量设为比较不重要。构成两两比较优先判断矩阵（表6）。

表6 功能性成分及抗氧化能力优先判断矩阵Table 6 Functional ingredients and antioxidant activity priority judgment matrix

根据优先判断矩阵使用SPSS在线分析系统，计算（计算方式参考李慧敏[29]）得出各指标权重系数，黄酮含量A为0.3485，多糖含量B、多酚含量C及抗氧化能力Y均为0.1846，挥发油D为0.0978。经一致性检验得出CR=0.0022<0.1,表明各指标的优先判断矩阵具有一致性,所得权重系数有效。则其综合评分结果Z=0.3485×A+0.1846×（B+C+Y）+0.0978×D。

从图1可以看出，天目箬竹得分最高，有0.8108，此外还有两种箬竹叶的评分较高，分别是长节箬竹和阔叶箬竹，分别得分0.7808和0.7678；髯毛箬竹、美丽箬竹、长耳箬竹得分稍低，分别得分0.5147、0.4817、0.5314；矮箬竹和胜利箬竹相比较得分更低，得分0.3975和0.3661；得分更低的是泡箬竹0.1903分和华箬竹0.2471分；得分最低的是米箬竹，仅得分0.0700。从综合评分的结果看出，天目箬竹的得分最高，是最好的加工原材料。尽管天目箬竹叶在功能性成分含量的单项中并不是最高的，但多项综合之后，却是最高的。加上其醇提取物的抗氧化能力是最高的，使其成为加工的首选箬竹叶原料。

图1 功能性成分及抗氧化能力权重分析综合评分Fig.1 Comprehensive score analysis of functional ingredients and antioxidant activity weights

3 结论

研究结果中出现了几种功能性成分单项数据很高的箬竹叶品种，如果进行单独提取某方面的研究，可以选择单项含量较高的品种。比如，黄酮含量最高的是长节箬竹和阔叶箬竹，分别为0.68±0.07%和0.67±0.06%；多糖含量最高的是髯毛箬竹，含有0.69±0.04%；多酚含量最高的是长节箬竹，含有0.62±0.09%，明显高于其他品种；挥发油含量最高的阔叶箬竹，含量为0.64±0.05%。抗氧化能力最强的是天目箬竹，得分0.8856。

功能性成分含量的单项差异和综合评分的结果可以为箬竹叶的开发选品提供重要参考。阔叶箬竹和长节箬竹这两种的综合评分很可观，仅比天目箬竹的综合评分低0.043和0.030，而且这两种的黄酮含量很高，是非常好的开发原料。从不同箬竹叶的营养成分差异中，可以看出箬竹叶是一种蛋白质提取的有效来源，而粗脂肪的存在无论对于蛋白质提取还是其他功能性成分的提取都是一种阻碍，所以对于箬竹叶的加工，还是需要粗脂肪含量更低的品种。天目箬竹的粗脂肪含量最低，并且最终在功能性成分及抗氧化能力综合评分中得分最高。所以天目箬竹的竹叶是综合开发的最佳选材。