PCV 与PEDV混合感染的实验室检测

杨克礼，陈文杰，郭 锐，周丹娜，袁芳艳，刘泽文，刘 威，高 婷，田永祥*

（1.农业农村部 畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室/湖北省农业科学院 畜牧兽医研究所，湖北 武汉 430064；2.畜禽病原微生物学湖北省重点实验室，湖北 武汉 430064）

猪 圆 环 病 毒（Porcine circovirus， PCV）是 目前已知最小的病毒之一，在分类学上属于圆环病毒科（Circoviridae）、圆环病毒属（Circovirus）［1］，是危害我国养猪业发展的主要致病病毒。在2019年以前，猪圆环病毒包含猪圆环病毒l型（Porcine cirovirus type l， PCV1）、猪圆环病毒2型（Porcine cirovirus type 2， PCV2）和猪圆环病毒3型（Porcine cirovirus type 3， PCV3）3个基因型［2-3］。研究证实：PCV1无致病性；PCV2和PCV3是猪圆环病毒病的主要病原体，可引发断奶仔猪多系统衰竭综合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome， PMWS）和猪皮炎与肾病综合征（Porcine dermatitis nephropathy syndrome， PDNS）等临床疾病；PCV3除引起母猪繁殖障碍、皮炎肾病综合征外，还会引起仔猪腹泻等［2-3］，给世界养猪业造成了巨大的经济损失［4］。2019年研究人员在我国湖南省患有呼吸系统疾病、腹泻和猪皮炎与肾病综合征的猪群中首次检测到了另一种新型猪圆环病毒——PCV4（Porcine cirovirus type 4），其 与 PCV1~PCV3型 具有明显的遗传差异［5］。随后有学者先后在河南、山西［6］、广西［7］和江苏［8］等地发现PCV4出现了流行。

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea， PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）引起的一种严重危害猪群的病毒性传染病。发病猪临床特征性表现主要有呕吐、水样腹泻、严重脱水等［9］；各年龄段猪只均可感染，以仔猪受害最重，死亡率在80%以上［10-11］。该病主要由带毒猪及其粪便经粪-口途径传播。近年来，猪流行性腹泻的发病率呈逐年上升趋势。自2010年以来，我国流行的PEDV毒株发生了变异，特别是S基因出现了多处插入和缺失，与经典毒株CV777相比毒力增强了［12］；高毒力PEDV变异株的出现严重影响了我国养猪业的发展［13］。

近年来，我国多地报道了有猪圆环病毒2型和猪流行性腹泻病毒2种甚至多种病原混合感染的情况［14-16］。为了解湖北省内规模化养猪场猪圆环病毒和猪流行性腹泻病毒的混合感染情况，笔者对来自该省内16个规模化养猪场的650份组织样品进行了实验室检测，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

逆转录酶M-MLV、d NTPs和Taq DNA聚合酶均购自北京全式金生物技术有限公司；病毒DNA/RNA提取试剂盒购自Axygen公司；琼脂糖及其他试剂均购自商业公司。

1.2 样品来源

2020年6~12月，从湖北省内16个规模化养猪场采集送检的病猪组织样品包括血液、脾脏和淋巴结等共490份，腹泻样品（包括病猪的肠及内容物）160份，共650份，置于-80 ℃保存备用。

1.3 样品处理及病毒DNA/RNA的提取

将组织样品按1∶5的比例（W/V）加入适量、pH 7.2的PBS液，置无菌匀浆器中，研磨匀浆，反复冻融3~5次，以8000~10000 r/min离心3~5 min，取上清液400 μL，按病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书中的方法提取核酸，立即用于检测或置于-80 ℃保存备用。

1.4 cDNA的合成

cDNA的 合 成 体 系 为20 μL体 系，其 中 含5×M-MLV反 转 录Buffer 4 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、M-MLV反 转 录 酶1 μL （100 U）、random Primer 1 μL （30 μmol/L）、Rnasin 1 μL、模板RNA 2 μL，用DEPC水补至20 μL。灭活（42 ℃ 2 h，95 ℃ 5 min）反转录酶，即得cDNA，立即用于检测或置于-80 ℃保存备用。

1.5 PCV及PEDV的检测

利用本研究室前期建立的猪圆环病毒多重PCR检测方法［1］检测PCV1、PCV2和PCV3。其引物序列如下： PCV1-F，5′-GAAAGTGAGCGGGAA GAT-3′； PCV1-R，5′-CTGATTGCTGGTAA TCAA-3′； PCV2-F，5′-CACATCGAGAAAG CGAAAGGAAC-3′； PCV2-R，5′-TGCGGGCCA AAAAAGGTACAGTT-3′； PCV3-F，5′-A GCAGTGCTCCCCATTGA-3′； PCV3-R，5′-TGGGCCCGACCAAATCCGG-3′。

PCR反应采用50 μL体系，包含10×PCR Buffer 5.0 μL、Taq聚合酶（5 U/μL） 0.5 μL、dNTPs （10 mmol/L） 4.0 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL、DNA模板5.0 μL，余下体积用DEPC水补足。

PCR反应条件：95 ℃预变性4 min； 94 ℃变性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共进行35个循环；最后72 ℃延伸8~10 min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳20~30 min，于紫外观测仪中观察记录结果。

PCV4的检测参照Sun等［7］报道的方法进行。PEDV的检测参照Ishikawa等［17］报道的方法进行。

1.6 数据统计

对16个养殖场的PCV1、PCV2、PCV3、PCV4或PEDV单一病原感染的阳性率，PCV1、PCV2、PCV3、PCV4或PEDV双重感染的阳性率，以及PCV1、PCV2、PCV3、PCV4或PEDV多重感染的阳性率分别进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单一病原感染的检测结果

对来自16个规模化猪场的650份组织病料，应用猪圆环病毒多重PCR检测方法、PCV4 PCR检测方法［7］、PEDV RT-PCR检测方法［17］分别进行PCV1-3、PCV4和PEDV的病原学检测，单一病原感染的检测结果详见表1。部分样品的检测结果见图1、图2。由表1可知：除PCV4未检出阳性外，PCV1、PCV2、PCV3或PEDV单一感染的样品阳性率分别为1.08%、4.15%、2.46%和6.46%；猪场PCV1、PCV2、PCV3或PEDV单一感染的最高阳性 率分别为4.35%、11.11%、8.33%和13.04%。

表1 单一病原感染的检测统计结果

图1 部分样品PCV的多重PCR扩增产物电泳图

图2 部分样品PEDV的RT-PCR扩增产物电泳图

2.2 双重感染的检测结果

对来自16个猪场的650份组织样品，应用猪圆环病毒多重PCR检测方法、PCV4 PCR检测方法和PEDV RT-PCR检测方法分别进行猪圆环病毒和猪流行性腹泻病毒的病原学检测，对双重感染的样品数分别进行统计，阳性数（阳性率）结果如表2所示：PEDV+PCV1感染的阳性数（阳性率）为2（0.31%），PEDV+PCV2为23（3.54%），PEDV+PCV3为5（0.77%），PCV1+PCV2为4（0.62%），PCV2+PCV3为10（1.54%），PCV3+PCV1为2（0.31%）。在所检测的16家规模化猪场中，由PEDV、PCV引起的双重感染主要是PEDV+PCV2和PCV2+PCV3 2种，其样品阳性率分别为3.54%和1.54%，分别占双重感染阳性样品总数的50.00%（23/46）和21.74%（10/46）。

2.3 多重感染的检测结果

对来自16个猪场的650份组织样品，应用猪猪圆环病毒多重PCR检测方法、PCV4 PCR检测方法和PEDV RT-PCR检测方法分别进行猪圆环病毒和猪流行性腹泻病毒的病原学检测，对多重感染的样品数分别进行统计，多重感染阳性数（阳性率）的结果（表3）如下：PEDV+PCV1+PCV2感染的阳性数（阳性率）为3（0.46%），PEDV+PCV2+PCV3为13（2.00%），PEDV+PCV1+PCV3为3（0.46%），PCV1+PCV2 +PCV3为4（0.62%），PEDV+PCV1+PCV2 +PCV3为4（0.62%）。在所检测的16家规模化猪场中，由PCV、PEDV引起的多重感染主要是PEDV+PCV2+PCV3，其样品阳性率为2.00%，占多重感染阳性样品总数的48.15%（13/27）。

表2 PCV、PEDV双重感染的检测统计结果

表3 PEDV、PCV多重感染的检测统计结果

2.4 不同感染类型场的阳性率统计结果

为了解不同感染类型场的阳性率，按不同感染类型对阳性场数及阳性率分别进行统计，结果见表4。由表4可知：单一感染的场阳性率以PEDV最高，达87.50%，其次为PCV2，达81.25%；双重感染的场阳性率以PEDV+PCV2最高，达75.00%，其次为PCV2+PCV3，达50%；多重感染的场阳性率以PEDV+PCV2+PCV3最高，达68.75%。

表4 PCV、PEDV不同感染类型场的阳性率统计结果

3 讨论

近年来，中国猪病流行出现了新的特点：传统疫病时有发生，并出现新的遗传变异和流行特点；新的疫病经常暴发，并呈现迅速蔓延之势；新发和再发传染病的暴发和流行使养猪业面临新的严峻挑战。猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒等传统病原仍是当前危害中国养猪业的主要病原，给养猪业造成了巨大的经济损失［15］。自2010年以来，由PEDV变异株所致仔猪腹泻的发病率、死亡率可达100%，危害程度远高于PEDV经典毒株［11］。2016年发现的猪圆环病毒3型、2019年发现的猪圆环病毒4型均被证实在中国猪群中广泛存在和流行［3，5，7］。

猪圆环病毒是引起感染猪产生免疫抑制的主要疾病，猪只在感染后机体免疫功能下降，疫苗免疫失败，从而并发或继发感染其他病原微生物［1］。本研究发现，猪圆环病毒除可与猪流行性腹泻病毒混合感染外，其3个基因型也常发生混合感染，且发生率较高，其中PCV2+PCV3的阳性率达1.54%，占双重感染阳性样品总数的21.74%；此阳性率虽然较前期调查发现的PCV2+PCV3混合感染的阳性率19.38%［18］有所下降，但PCV2+PCV3混合感染的场阳性率达50.00%，说明其仍在湖北省内的养殖场流行，应注意加强防控。本次对650份组织样品的检测未发现PCV4的流行，究其原因，可能是湖北省尚未发生该病，亦可能是检测的养殖场数量有限，未能采集到PCV4的感染组织。

PEDV是危害养猪业的主要病原之一。自2010年以来，由PEDV所引起的仔猪腹泻给我国的养猪业造成了极大的经济损失［13，21］。随着PEDV变异株的流行，我国多地出现了PEDV混合感染的报道［16］。徐丽华等［19］对浙江省546份样本的病原学检测结果表明，PEDV的阳性率为71.25%，双重混合感染以PEDV+PoRV为主；郭晓秋等［20］报道了豫南地区218个规模猪场仔猪腹泻主要的病原体是PEDV（94.5%），其中混合感染非常普遍，以PEDV+PCV2混合感染为主的双重感染最为严重。本研究发现湖北省内PEDV的混合感染以PEDV+PCV2和PEDV+PCV2+PCV3为主，分别占双重感染阳性样品总数的50.00%和多重感染阳性样品总数的48.15%，与郭晓秋等［20］的报道结果相似。相关研究发现PCV2阳性母猪所产仔猪在感染PEDV后，PEDV阳性细胞的数量显著高于PCV2阴性母猪所产仔猪的，说明PCV2影响了PEDV的复制，在PCV2和PEDV之间可能发生了协同作用［22］，这可能是临床上PEDV和PCV2混合感染病例较多的主要原因。

本次对湖北省内650份组织样品的检测结果表明，湖北省PEDV病原单一感染的阳性率为6.46%，混合感染的阳性率为8.15%，均大大低于王颢然等［16］报道的湖北省PEDV单一感染阳性率70.37%和混合感染阳性率57.41%，这可能是因为在后非洲猪瘟时代规模化养殖场管理人员的生物安全意识增强，实施了更加科学合理的生物安全防控措施，使得各类疫病的发病率均有不同程度的降低。尽管如此，考虑到免疫压力和PCV、PEDV在进化过程中的遗传多样性，今后仍然需要加强对PCV、PEDV的防控。在针对非洲猪瘟、PEDV及PCV进行预防的同时，还要注意其他病原与PEDV、PCV发生混合感染。平时应加强对PEDV、PCV和其他病原体的检测，针对养殖场的实际情况，制定科学合理的免疫程序，按时对猪舍进行日常消毒，使猪群处于良好的生长环境，提高猪群的免疫力，减少各类病原的感染。