野生火棘果活性成分及抗氧化和抑菌性的研究

宋小娟，杨卫灵，张清海，胡迪，付国伟

（贵州医科大学公共卫生学院，贵州 贵阳 550025）

火棘（Pyracantha fortuneana）又称火把果、红子，主要生长在海拔500 m～2 800 m的山地，目前已被国家卫生部批准作为食品新资源食用果品[1]。我国野生火棘果资源丰富，占世界总资源的70%，国内资源主要以四川、贵州、陕西、云南、湖南、湖北等省为主要产地，如湖北年均产果1亿吨，贵州年均产果2 500万吨以上。火棘是一种可药可食可观赏的多用途花果植物，具有很高的药用价值和食用价值[2]，其果实成熟后为橙红色或红色，甜酸适口、香气浓郁、微涩，但果实小，平均单果重仅为0.177 g[3]，其含有种类齐全的天然色素、氨基酸、微量元素[4]、多酚、多糖[5]和维生素等营养成分，具有抗氧化、抗病毒、抗细菌、抑制肿瘤、增强免疫力、利胆、助消化、促进血凝等多种功效，在医疗、保健方面有广阔的开发前景。

大量研究表明火棘多糖能抑制人体外培养的MDAMB-231乳腺癌细胞的生长[6]，槲皮素、芦丁和原花青素可显著降低体重、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和丙二醛水平，对高脂血症和肥胖的改善与内源性抗氧化活力的提高密切相关[7-8]。氨基酸作为蛋白质的基本组成单位，是评价食品质量及营养价值的重要指标[9-12]，影响着食品风味[13]。一些特殊氨基酸如支链氨基酸有提高运动能力、抗疲劳功效[14]，明确氨基酸种类及组成是食品、保健品等开发的重要依据之一。

火棘果的研究主要是活性成分的提取利用、火棘果果醋、火棘果复合饮料、火棘果美白产品等。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）所导致的酶促褐变是果蔬汁加工和贮藏面临的难题之一，打浆过程中，在氧气存在条件下，富含PPO的果蔬汁容易褐变，在防止酶促褐变方面通常采用物理、化学、生物方法对鲜榨果蔬汁进行处理[15]，火棘果的PPO活力未见研究报道。研究表明，火棘果中含有抗氧化活性成分除了VC、多酚、花青素、黄酮醇以外，还含有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化酶[16]。

本研究采用柱前衍生-高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC） 测定贵州不同地区野生火棘果中水解氨基酸种类与含量，并分析火棘果实的可滴定酸、总糖、维生素C、总酚、总黄酮含量，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羟基自由基（·OH）清除率以及火棘果提取物的抑菌作用等指标，为野生火棘果资源的研究与利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

火棘果：采自贵州省黔西南、黔南、铜仁地区以及贵安新区等地共12个样品，具体来源见表1。新鲜的火棘果采摘后放入保鲜袋中，储藏于-80℃超低温冰箱。

表1 火棘果来源Table 1 The source of Pyracantha fortuneana

乙腈（色谱纯）：美国Tedia公司；三乙胺（色谱纯）、异硫氰酸苯酯（色谱纯）、正己烷（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；乙酸钠、丙酮、邻苯二酚（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；浓盐酸、浓硫酸（均为分析纯）：重庆川东化工（集团）有限公司；氨基酸标准品（≥98.0%）：北京索莱宝科技有限公司；苯酚（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；福林酚试剂（生物试剂）：上海源叶生物科技有限公司；芦丁标准品（≥98.0%）、没食子酸标准品（≥98.0%）：合肥博美生物科技有限责任公司；SOD试剂盒：南京建成生物工程研究所。

受试菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、沙门氏菌（Salmonella）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、费氏柠檬酸杆菌（Citrobacter fischeri）由贵州医科大学公共卫生学院食品科学系实验室提供。

1.2 主要仪器与设备

1260型高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；1510型酶标仪：赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；Haier医用低温保存箱（-80℃）：青岛海尔特种电器有限公司；Scientz-50F型真空冷冻干燥机：宁波新芝生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 火棘果中水解氨基酸种类与含量的测定

采用异硫氰酸苯酯柱前衍生-高效液相色谱法测定火棘果中水解氨基酸种类与含量[17-18]。

1.3.2 火棘果中营养成分及活性成分的测定

采用苯酚-硫酸法测定总糖含量[19]、酸碱滴定法测定可滴定酸含量[20]、固蓝B盐法测定维生素C含量[21]，Folin-Ciocalteus法测定总酚含量[22]，结果以每克所含没食子酸当量来表示（mg GAE/g），以芦丁为标注品测定总黄酮含量[23]，结果以每克所含芦丁当量来表示（mg Rutin/g）。

1.3.3 超氧化物岐化酶（SOD）活力与多酚氧化酶（PPO）活力测定

1.3.3.1 SOD活力测定

将火棘果放在研钵中，在4℃条件下研磨至糊状，准确称取0.2 g火棘果样品至2 mL离心管中，按照料液比 1 ∶9（g/mL）加入混合磷酸缓冲液（pH 6.0），振荡3 min，静置10 min后取清液备用。根据SOD试剂盒中植物组织中SOD的测定步骤，于450 nm测定。

1.3.3.2 PPO活力测定

称取5 g火棘果放在研钵中，4℃下加少量pH 6.0的混合磷酸盐缓冲液（预先冷藏）研磨，再加入10 mL混合磷酸盐缓冲液，于4℃静置20 min，取上清液经10 mL丙酮沉淀，取沉淀，然后向沉淀中加入10mL磷酸盐缓冲液，得待测酶液，置4℃下备用。取0.02 mol/L的邻苯二酚溶液1 mL与混合磷酸缓冲液1.5 mL，于30℃保温5 min，再加1 mL的待测酶液，迅速混匀后在波长410 nm处测定吸光度，每隔1 min记录1次吸光度，共记录3 min，重复测定3次。

1.3.4 火棘果体外抗氧化活性测定

结合样品的水解氨基酸组成、总酚以及总黄酮含量等指标，选择来源为清镇市的12号火棘果进一步研究其体外抗氧化活性。火棘果样品制备成匀浆，与无水乙醇按 1∶10（g/mL）的料液比混合，超声 30 min，取上清液进行抗氧化活性的测定。火棘果的DPPH·清除率、·OH清除率、ABTS+·清除率均参照文献[24]方法进行测定，分别以2、4 mg/mL的维生素C为阳性对照。

1.3.5 火棘果提取物的抑菌作用

1.3.5.1 受试菌株的活化

将受试细菌接种于LB肉汤培养基中，生化培养箱中37℃培养20 h～22 h，菌浓度调为1.0×105CFU/mL备用。

1.3.5.2 火棘果醇提物的制备及抑菌试验

将12号样品进行粉碎，按照1∶10（g/mL）的料液比混合到75%乙醇中，超声30 min后，放入60℃的水浴中超声辅助提取2 h，离心取上清液在50℃下旋转蒸发浓缩，浓缩液经真空冷冻干燥后用无菌水配制为浓度50 mg/mL溶液，用0.45 μm孔径滤膜过滤除菌，采用平板扩散法测定其对受试细菌的抑菌作用，以无菌水为空白对照，75%乙醇为阳性对照，测定抑菌圈直径，单位mm。

2 结果与分析

2.1 火棘果中水解氨基酸的种类和含量

12个不同来源的火棘果水解氨基酸种类与含量如表2～表3所示。

表2 火棘果种子氨基酸种类和含量Table 2 Species and content of amino acids in seed of Pyracantha fortuneana mg/g

续表2 火棘果种子氨基酸种类和含量Continue table 2 Species and content of amino acids in seed of Pyracantha fortuneana mg/g

表3 火棘果果肉氨基酸种类和含量Table 3 Species and content of amino acids in pulp of Pyracantha fortuneanamg/g

由表2～表3可知，不同来源的火棘果种子和果肉所含氨基酸种类和含量存在差异，其中火棘果种子所含氨基酸种类和含量明显高于果肉中，火棘果种子的氨基酸总量在33.09 mg/g～124.56 mg/g，火棘果果肉氨基酸总量为6.04 mg/g～35.94 mg/g。其中，5号火棘果种子的氨基酸总量最高，6号火棘果种子的氨基酸总量最低；10号火棘果果肉的氨基酸总量最高，12号火棘果果肉氨基酸总量最低。

火棘果种子必需氨基酸总量在13.80 mg/g～52.99 mg/g，必需氨基酸的范围分别为苏氨酸2.56mg/g～20.49mg/g，缬氨酸 0.48mg/g～1.75mg/g，蛋氨酸 0.96mg/g～25.46 mg/g，异亮氨酸 0.63 mg/g～9.45 mg/g，亮氨酸2.03 mg/g～7.56 mg/g，苯丙氨酸 2.09 mg/g～3.07 mg/g，赖氨酸1.33 mg/g～1.78 mg/g，必需氨基酸与氨基酸总量的比值（EAA/TAA）为 0.32～0.49，氨基酸评分（AAS）为2.04～3.11。

火棘果果肉必需氨基酸总量在2.91 mg/g～11.16mg/g，必需氨基酸的范围分别为苏氨酸0.63mg/g～4.84mg/g，缬氨酸 0.12mg/g～0.53 mg/g，蛋氨酸 0.22 mg/g～1.89 mg/g，异亮氨酸0.18 mg/g～1.76 mg/g，亮氨酸0.25 mg/g～2.85 mg/g，苯丙氨酸 0.24 mg/g～1.22 mg/g，赖氨酸0.55 mg/g～1.03 mg/g，必需氨基酸与氨基酸总量的比值（EAA/TAA）为 0.29～0.71，氨基酸评分（AAS）为1.42～3.51。联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）/世界卫生组织（World Health Organization，WHO）于1973年提出，EAA/TAA值为0.4左右，则为蛋白质的理想模式[25]。因此，火棘果可作为理想的蛋白质来源。

2.2 火棘果中功能性氨基酸的种类与含量

不同来源的火棘果中功能性氨基酸的种类和含量如表4所示。

表4 火棘果中功能性氨基酸种类和含量Table 4 Species and content of functional amino acids in Pyracantha fortuneana mg/g

由表4可知，火棘果中呈味氨基酸与药效氨基酸主要在火棘果种子中，火棘果种子中甜味氨基酸含量在15.89 mg/g～34.12 mg/g，鲜味氨基酸含量为5.86 mg/g～18.97 mg/g，苦味氨基酸含量为12.24 mg/g～31.87 mg/g，药效氨基酸总量为25.54 mg/g～109.63 mg/g。种子中支链氨基酸总量为3.76 mg/g～13.11 mg/g，远高于火棘果肉的含量。由此可知，火棘果种子是火棘果功能性氨基酸主要存在的部位。

2.3 不同来源火棘果的营养成分

不同来源火棘果的营养成分如表5所示。

表5 不同来源火棘果中营养成分及含量Table 5 Nutrient constituents and contents of Pyracantha fortuneana from different sources

由表5可知，火棘果样品中总糖含量范围在85.70 mg/g～339.34 mg/g，其中6号样品总糖含量为（339.34±0.22）mg/g，显著高于其他火棘果（p<0.05），总糖含量最低的是3号样品，含量为（85.70±0.02）mg/g。火棘果样品中可滴定酸含量在5.57%～10.01%，其中5号样品可滴定酸显著高于其他地区来源的火棘果（p<0.05）。大量研究表明，火棘果在成熟过程中，营养成分会发生动态变化，随着果实的成熟糖含量增加，有机酸和单宁含量下降，果实的酸涩味也降低。火棘果中维生素C含量为8.17 mg/100 g～12.67 mg/100 g，比柑橘、苹果和梨都要高，仅低于猕猴桃。

大量研究表明，火棘果具有较高的药用价值和食用价值，其中多酚类物质和黄酮类物质具有抗菌、抗肿瘤、增强人体免疫力以及抗氧化等活力，本研究中12号和6号样品的总酚含量显著高于其他地区的火棘果（p＜0.05），分别为（1.82±0.05）mg GAE/g和（1.77±0.02）mg GAE/g，12号和5号样品的总黄酮含量分别为（6.12±0.10）mg Rutin/g和（6.32±0.44）mg Rutin/g，显著高于其他地区样品（p＜0.05）。

2.4 不同来源火棘果的PPO活力和SOD活力

火棘果的多酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力如图1所示。

图1 不同来源火棘果的PPO活力与SOD活力Fig.1 PPO activity and SOD activity of Pyracantha fortuneana from different sources

如图1所示，不同来源火棘果的PPO酶活力在10.00 U/g～20.00 U/g，PPO是导致食品酶促褐变的主要酶类，特别是在饮料的加工过程中，影响饮料的性质和品质，因此饮料加工原料的PPO活力的测定尤为重要。火棘果SOD活力在140.72 U/g～888.56 U/g，其中5号样品的SOD活力最高，3号样品的SOD活力最低。由此表明，火棘果可用作具有美白抗氧化的化妆品、保健功效功能性产品以及医药原料。

2.5 火棘果的抗氧化活性

12号火棘果醇提物的体外抗氧化活性如表6所示。

表6 火棘果提取液的抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of Pyracantha fortuneana extract%

由表6可知，来源于清镇的12号火棘果采用乙醇超声后，其提取液的ABTS+·清除率为99.59%，DPPH·清除率为96.15%。与2mg/mL以及4 mg/mL的维生素C阳性对照组的无显著差异（p＞0.05）。ABTS+自由基以及DPPH自由基的清除能力可能是与火棘果富含的多酚类以及黄酮类物质的含量相关。但2mg/mL和4 mg/mL的维生素C阳性对照组的·OH清除率约为火棘果提取液的3倍，羟基自由基（·OH）是生物体内极具反应性的自由基，其清除能力可能与多糖、有机酸等物质相关。

2.6 火棘果提取物的抑菌作用

火棘果醇提物对受试菌株的抑菌作用如表7和图2所示。

表7 火棘果提取物的抑菌作用Table 7 Antibacterial action of Pyracantha fortuneana extract

图2 火棘果提取物对细菌的抑菌作用Fig.2 Antibacterial effect of Pyracantha fortuneana extract on bacteria

由图2可知，火棘果提取物浓度为50 mg/mL，对受试细菌均有抑菌作用。由表7可知，火棘果提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌抑菌效果显著优于其他受试菌株（p<0.05），且50 mg/mL的火棘果提取物的抑菌效果显著优于75%乙醇。

3 结论

火棘果中共检测出17种水解氨基酸，其中包括7种人体所需的必需氨基酸。12个不同地区火棘籽的氨基酸种类和含量明显高于果肉中，其EAA/TAA符合FAO/WHO提出的理想模式，且火棘籽中富含大量的功能性氨基酸。火棘果样品的SOD活力在140.72 U/g～888.56 U/g，总酚含量最高为（1.82±0.05）mg GAE/g，总黄酮含量最高为（6.32±0.44）mg Rutin/g。12号样品的醇提液对ABTS+·、DPPH·以及·OH均有一定的清除能力，且浓度为50 mg/mL火棘果提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌效果显著优于其他受试菌株（p<0.05）。综上所述，野生火棘果氨基酸种类齐全且含量丰富，有较强体外抗氧化能力，同时对常见导致腐败的微生物有抑制作用，具有一定的开发利用价值。