卷叶病对蛇龙珠葡萄酒香气特征的影响

孙丽君， 廖祖宋， 陈 文， 张 众， 李 伟， 夏鸿川， 张军翔,5,*

(1.宁夏大学 农学院， 宁夏 银川 750021； 2.宁夏西鸽酒庄有限公司， 宁夏 银川 751608；3.宁夏大学 食品与葡萄酒学院， 宁夏 银川 750021；4.宁夏大学 生命科学学院， 宁夏 银川 750021；5.中国葡萄酒产业技术研究院， 宁夏 银川 750021)

葡萄卷叶病(grapevine leafroll disease, GLD)最早于1958年在美国加利福尼亚被发现[1]，由卷叶病毒(grapevine leafroll-associated viruses, GLRaVs)引起，以叶片反卷，叶肉红色，叶脉绿色为表型特征，是世界上分布范围最广、危害程度最严重的葡萄病毒病之一[2]。研究表明，卷叶病毒可使葡萄减产3%～68%[3]，延缓果实成熟，减少可溶性固形物、花色苷以及总糖含量，并增加果汁中的可滴定酸度[4-6]。

蛇龙珠(Cabernetgernischt)是优良的红色酿酒葡萄品种，但其抗病毒病的能力较弱，尤其对卷叶病毒敏感[7- 8]。卷叶病毒感染葡萄植株后会调节宿主代谢途径，导致其生长发育迟缓，树势衰退，而植株感病后难以根治，终生带毒，造成持续性危害[9]。蛇龙珠是宁夏贺兰山东麓的主栽品种之一[10]，抗旱性和抗瘠薄能力强，即使在贫瘠的西北土壤中仍能获得理想的产量[11]。目前国内外大多数研究都集中在引起葡萄卷叶病的病原体本身，如卷叶病毒的遗传多样性及亲缘关系、改进检测方案等方面[12-14],有关卷叶病毒对蛇龙珠葡萄酒香气特征及其物质基础的研究鲜有报道。

葡萄酒香气质量的好坏会直接影响消费者的感官体验，而香气的浓郁度、优雅度、纯正度、协调性是评价葡萄酒香气品质的重要参数，由香气物质的种类和含量决定[15]。本研究选取贺兰山东麓感病和未感病的蛇龙珠葡萄，在栽培方式、管理模式、采收期以及后期的酿造工艺均保持一致的前提下，明确感病蛇龙珠葡萄酒的香气特征，并进一步探究香气特征形成的物质基础，帮助葡萄种植者和葡萄酒酿造者更加直观地了解卷叶病对蛇龙珠葡萄酒香气品质的影响，以提高他们对葡萄卷叶病的认识及重视程度，研究也希望对贺兰山东麓蛇龙珠葡萄原料的合理利用、产品质量的提升和工艺的改进提供一定帮助。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄原料：蛇龙珠酿酒葡萄原料于2019年10月2日采自宁夏西鸽酒庄有限公司葡萄园。以叶片反卷，叶肉红色，叶脉绿色为表型病株，以健康植株为对照；两种类型葡萄均来自同一葡萄园，栽培方式、管理模式、采收期保持一致(可溶性固形物质量分数：感病23.4%，未感病24.8%)。

酚酞、无水葡萄糖、次甲基蓝、氯化钠、氯化钾，均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钠、无水碳酸钠、无水硫酸钠、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、邻苯二甲酸氢钾，均为分析纯，天津市大茂化学试剂有限公司；4-甲基-2-戊醇，日本TCI公司；果胶酶、酿酒活性干酵母、乳酸菌干粉、偏重亚硫酸钾，法国Lamothe-Abiet公司；C8～C20正构烷烃，美国Sigma-Aldrich公司；香气物质标准品，美国Sigma-Aldrich公司和日本TCI公司。

1.2 仪器与设备

TU- 1901型分光光度计，北京普析仪器有限责任公司；雷磁PHS- 3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司； 7890 B型气相色谱- 7000 D型质谱仪、DB- Wax色谱柱(30 m×250 μm, 0.25 μm)，美国Agilent公司；DVB/CAR/PDMS型萃取头(50/30 μm, 1 cm)，美国Supelco公司； ODP- 4型嗅觉检测器，德国Gerstel有限公司； LC- DCY- 12GK型氮吹仪，上海力辰邦西仪器科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1葡萄酒酿造

葡萄采收后立刻进行分选，感病和未感病的葡萄原料分开处理，各重复3次，去除霉烂果及二次果，随后除梗、破碎，泵入1 t不锈钢发酵罐，葡萄入罐体积达到20%左右时，在螺杆泵处均匀添加30 mg/L果胶酶和60 mg/L偏重亚硫酸钾，偏重亚硫酸钾与果胶酶间隔添加，启动酒精发酵前8 ℃冷浸渍2～3 d；酵母的接种量为150 mg/L，酒精发酵温度25～28 ℃，酒精发酵结束后进行皮渣分离，接种0.01 g/L的乳酸菌进行苹果酸- 乳酸发酵，发酵温度保持在18～20 ℃，结束后进行转罐并添加120 mg/L的偏重亚硫酸钾。

1.3.2理化指标测定

乙醇体积分数、还原糖、可滴定酸、挥发酸、干浸出物的测定参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，pH值使用雷磁pH计测定，总酚、单宁、总花色苷的测定参照李辉等[16]的方法，色度、色调测定参照王琨等[17]的方法。

1.3.3香气成分分析

参考白雪菲等[18]的方法利用顶空固相微萃取结合气相色谱- 质谱仪对香气物质进行提取分析。将DVB/CAR/PDMS萃取头(50/30 μm,1 cm)在250 ℃条件下老化10 min；称取1.5 g NaCl于顶空瓶中，加入5 mL酒样以及10 μL 4-甲基-2-戊醇(1.008 3 g/L)，40 ℃预热5 min后将萃取头插入顶空瓶，40 ℃萃取30 min；采取不分流模式进样，进样口温度240 ℃，解吸10 min，载气为高纯氦气(纯度≥99.999%)，流速1 mL/min；初始温度40 ℃，保持5 min，然后以3 ℃/min升至97 ℃保持7 min，再以2 ℃/min升至120 ℃，以3 ℃/min升至150 ℃，最后以8 ℃/min升至220 ℃保持10 min；传输线温度230 ℃，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，扫描范围m/z35～300。同时采用液液萃取法对葡萄酒香气物质进行提取并通过ODP- 4型嗅觉检测器嗅闻。量取20 mL葡萄酒于50 mL离心管中，加入 15 mL二氯甲烷和2g NaCl，同时加入80 μL 4-甲基-2-戊醇(18 μg/mL)作为内标参照。将此样品涡旋处理10 min、超声处理20 min后静置分层，然后用一次性针管将有机相抽取出来，加入4 g无水硫酸钠干燥过夜。最后将萃取液氮吹浓缩至1 mL，密封后置于-20 ℃冰箱保存待用。

GC- O方法：采用7890 B型GC仪配ODP- 4型嗅觉检测器端口进行嗅闻分析。进样量1 μL，气相色谱流出物在氢火焰离子化检测器和嗅探口中按1∶1的比例进行分流。DB- Wax色谱柱(30 m×250 μm,0.25 μm)，载气(氦气)流速为1 mL/min。初始温度为40 ℃，保持5 min，然后以5 ℃/min升至230 ℃保持5 min。MS传输线温度230 ℃，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，扫描范围m/z35～300。嗅闻仪传输线和嗅闻口温度分别为260 ℃和220 ℃，加湿器流速12 mL/min。对香气物质采用强度分析法，嗅闻实验由6位经过训练的评价员完成，每人嗅闻2次，记录香气物质的强度(1弱、2中等、3强烈、4极强)和香气特征。

定性与定量：香气物质利用质谱全离子扫描模式定性，依据色谱保留时间和质谱信息在NIST 17标准谱库中检索，同时计算RI值[19]，并与相关文献值对比。对已有标准品的香气化合物，利用其标准曲线进行定量，无标准品的8-甲基壬酸甲酯、9-十六碳烯酸乙酯、邻苯二甲酸丁辛酯、4-氨基-1,5-戊二酸4种香气化合物以4-甲基-2-戊醇为内标进行半定量。

1.3.4香气特征感官分析

感官品评小组由20名具有2年以上葡萄酒品尝经验的专业人员(年龄22～45岁、男女比例1∶1)组成，以盲品的形式进行，在标准品酒室(ISO 8589—1998)使用标准品酒杯(ISO 3591—1997)品鉴，参照国际葡萄与葡萄酒组织制定的百分制评价体系的评分标准对感病和未感病蛇龙珠葡萄酒香气品质进行打分[15]，香气评分依据见表1。

表1 香气评分依据Tab.1 Benchmark for aroma evaluation

1.3.5香气重构和缺失实验设计

香气重构实验[20]：筛选感病蛇龙珠葡萄酒中香气活度值(OAV)大于1和香气强度值大于3的香气物质进行香气重构实验。重构酒样以模拟溶液作为基质，按照香气物质在酒中的浓度进行添加重构。由20名专业品评人员依据Davis香气轮盘共同讨论出红色水果、热带水果、中药、奶油、香料、酒精味6个词汇对感病蛇龙珠葡萄酒香气特征进行描述。选定描述词后，由专业品评小组对感病蛇龙珠原酒及重构酒样的6个香气属性进行强度打分(1～10分)。

香气缺失实验[20]：以缺失具有草药味香气特征的异戊酸香叶酯的葡萄酒为缺失模型，对照为重构酒样。选用15名香气区分能力良好的品评人员进行三角品尝实验。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2016软件进行基本数据统计与计算；利用SPSS 25.0软件对数据进行t检验，分析感病蛇龙珠葡萄酒与未感病蛇龙珠葡萄酒品质是否存在显著差异；使用Origin 2018软件绘图。

2 结果与分析

2.1 感病和未感病蛇龙珠葡萄酒理化指标分析

酿酒学参数是了解葡萄酒品质的关键。感病与未感病蛇龙珠葡萄酒的基本酿酒学参数如表2。酒精度、干浸出物和残糖能使葡萄酒更加圆润饱满，未感病蛇龙珠葡萄酒的酒精度比感病蛇龙珠葡萄酒高出8.2%，而残糖和干浸出物的质量浓度没有显著差异(P>0.05)。酸度能给葡萄酒带来清爽感，感病蛇龙珠葡萄酒的可滴定酸质量浓度显著高于未感病蛇龙珠葡萄酒(P<0.05)。二者pH值没有显著差异。挥发酸能反映葡萄酒的健康状况，2种葡萄酒中挥发酸质量浓度没有显著差异，说明卷叶病毒的感染并不会影响葡萄酒的挥发酸质量浓度。酚类物质是植物次生代谢产物，对红葡萄酒的颜色、味道和结构有贡献，并对人体健康有潜在益处，而且酚类

表2 卷叶病对蛇龙珠葡萄酒理化指标的影响Tab.2 Effect of GLD on physicochemical parameters of Cabernet gernischt wine

物质质量浓度的高低决定了葡萄酒陈酿潜力的大小[6]。感病蛇龙珠葡萄酒总花色苷质量浓度和总单宁质量浓度与未感病蛇龙珠葡萄酒相比分别低出18.2%和7.3%；总酚质量浓度虽有升高趋势，但未达到统计学上的显著水平(P>0.05)。颜色是消费者对葡萄酒质量判断的重要参考因素，感病蛇龙珠葡萄酒的色调值显著低于未感病蛇龙珠葡萄酒，而色度值没有显著性差异，说明卷叶病毒的感染主要影响了葡萄酒颜色的深浅，而对葡萄酒颜色的饱和度没有显著影响。

2.2 感病和未感病蛇龙珠葡萄酒香气特征感官分析

感病和未感病蛇龙珠葡萄酒香气特征感官评价见表3。从表3可以看出，感病蛇龙珠葡萄酒的纯正度、浓郁度得分均显著低于未感病蛇龙珠葡萄酒，但2种蛇龙珠葡萄酒香气总评分没有显著性差异。未感病蛇龙珠葡萄酒果香浓郁，青椒等生青气味较为明显，具有该品种葡萄酒典型香气特征；而感病蛇龙珠葡萄酒带有明显的藿香、甘草、陈皮等中药香气特征，该香气特征能使感病蛇龙珠葡萄酒明显区别于未感病蛇龙珠葡萄酒。

表3 葡萄酒香气的感官评价Tab.3 Sensory evaluation of wine aroma

2.3 感病和未感病蛇龙珠葡萄酒香气成分分析

为了探究感病蛇龙珠葡萄酒中药香气特征形成的物质基础，对感病和未感病蛇龙珠葡萄酒的香气物质进行了检测。本研究共检测出55种香气化合物(见表4)，分为酯类、高级醇、脂肪酸、醛酮、萜烯类、挥发性酚6个类别，其中高级醇和酯类化合物的总占比高达90%以上。

葡萄酒中大多数酯类物质能给葡萄酒带来果香和花香。从表4可以看出，在2种葡萄酒中除丁酸乙酯、辛酸甲酯、癸酸甲酯、癸酸异丁酯和亚油酸乙酯外，其他具有花果香气的酯类物质(2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、己酸异戊酯、壬酸乙酯、8-甲基壬酸甲酯、癸酸乙酯、辛酸异戊酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、癸酸-3-甲基丁酯、丁酸戊酯)在未感病蛇龙珠葡萄酒中的质量浓度均显著高于感病蛇龙珠葡萄酒。具有脂肪气味特征的月桂酸异戊酯、棕榈酸乙酯在感病蛇龙珠葡萄酒中的质量浓度显著高于未感病蛇龙珠葡萄酒。具有生青气味的9-癸烯酸乙酯在未感病蛇龙珠葡萄酒中的质量浓度显著高于感病蛇龙珠葡萄酒。具有酒香味的琥珀酸二乙酯，具有蜂蜡和鸢尾等中药材气味的肉豆蔻酸乙酯，具有乳香的乳酸乙酯在感病蛇龙珠葡萄酒中的质量浓度显著高于未感病蛇龙珠葡萄酒。从酯类物质的总量上来说，感病蛇龙珠葡萄酒中酯类物质的总质量浓度显著低于未感病蛇龙珠葡萄酒，但感病蛇龙珠葡萄酒酯类物质质量浓度在香气物质总量的占比高于未感病蛇龙珠葡萄酒的占比。

高级醇是葡萄酒酒精发酵的主要副产物，2种蛇龙珠葡萄酒中共检测出了14种醇类物质。其中，具有花果香气特征的2，3-丁二醇、苯乙醇、2,6,8-三甲基-4-壬醇在未感病蛇龙珠葡萄酒中的质量浓度显著高于感病蛇龙珠葡萄酒。具有生青气味的C6醇，如3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、正己醇在未感病蛇龙珠葡萄酒中的质量浓度均高于感病蛇龙珠葡萄酒，其中3-甲基-1-戊醇的质量浓度差异达到了显著水平。具有木质香的香紫苏醇仅在未感病蛇龙珠葡萄酒中检出，这种香气化合物的出现在一定程度上可能会增加葡萄酒香气的复杂性。杂醇油香气的出现能在一定程度上增加葡萄酒的醇香，本研究发现感病蛇龙珠葡萄酒中异丁醇、正丁醇这2种具有杂醇油香气特征的化合物质量浓度显著低于未感病蛇龙珠。具有淡奶油香气的正癸醇在感病蛇龙珠葡萄酒中的质量浓度显著高于未感病蛇龙珠葡萄酒。具有黄油味的苯甲醇和异戊醇在未感病蛇龙珠葡萄酒中的质量浓度显著高于感病蛇龙珠葡萄酒。其他香气特征的高级醇在未感病蛇龙珠葡萄酒中的质量浓度均显著高于感病蛇龙珠葡萄酒，如具有硫化物味和洋葱味的3-甲硫基丙醇。从高级醇类物质的总量上来说，感病蛇龙珠葡萄酒显著低于未感病蛇龙珠葡萄酒。

表4 葡萄酒香气物质分析Tab.4 Analysis of wine aroma components

续表4

羰基化合物(醛、酮)也是发酵微生物的代谢产物，检测出的具有花香特征的2,6,8-三甲基-4-壬酮、1-羟基环己基苯基甲酮在未感病蛇龙珠葡萄酒中的质量浓度显著高于感病蛇龙珠葡萄酒。具有黄油气味的2,3-戊二酮在感病蛇龙珠葡萄酒中的质量浓度显著高于未感病蛇龙珠葡萄酒。脂肪酸往往给葡萄酒带来不愉悦的香气感受，本研究发现辛酸和癸酸在感病蛇龙珠葡萄酒中的质量浓度显著高于未感病蛇龙珠葡萄酒，但脂肪酸的总量在2种蛇龙珠葡萄酒中没有显著差别。具有汽油、花香特征的苯乙烯在感病蛇龙珠葡萄酒中的质量浓度显著低于未感病蛇龙珠葡萄酒。

2.4 感病和未感病蛇龙珠葡萄酒香气主成分分析

图1 主要香气物质主成分分析Fig.1 Principal component analysis of main aroma components

为了进一步探究在感病和未感病蛇龙珠葡萄酒中起主要作用的香气物质，选择OAV大于1的21种挥发性香气物质(如表5)作为自变量进行主成分分析，结果见图1。由图1可知， PC1可以解释97.2%的初始变量，能够将感病和未感病蛇龙珠葡萄酒区分开，未感病蛇龙珠葡萄酒位于PC1正半轴，感病蛇龙珠葡萄酒位于PC1负半轴。由图1中香气物质分布可知， 在未感病蛇龙珠葡萄酒中起主要贡献作用的物质有直链脂肪酸乙酯 (如癸酸乙酯、庚酸乙酯、月桂酸乙酯、正己酸乙酯和辛酸乙酯)、支链脂肪酸酯 (如异戊酸乙酯、辛酸异戊酯、己酸异戊酯)、芳香烯(苯乙烯)、高级醇(如苯乙醇、异戊醇、3-甲硫基丙醇)和高级醇乙酸酯(如乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯)，这些化合物主要具有果香和花香，符合未感病蛇龙珠葡萄酒的感官香气特征。在感病蛇龙珠葡萄酒中起主要贡献作用的物质有挥发性酚(2,4-二叔丁基苯酚)、羰基化合物(2,3-戊二酮)、直链脂肪酸乙酯(棕榈酸乙酯、丁酸乙酯、9-癸烯酸乙酯)、直链脂肪酸甲酯(辛酸甲酯)、中短链脂肪酸(癸酸)。

表5 葡萄酒中部分香气物质香气活度值Tab.5 OAV of some aromatic components in wine

2.5 GC- O嗅闻分析

GC- O嗅闻结果见表6。嗅闻分析共检测出25种风味化合物。其中，对感病蛇龙珠葡萄酒整体风味贡献较大(香气强度>3)的化合物有异戊酸乙酯、异戊醇、正己酸乙酯、乙偶姻、乳酸乙酯、辛酸乙酯、2-甲基己酸、琥珀酸二乙酯、3-甲硫基丙醇、苯甲醇、苯乙醇、辛酸、异戊酸香叶酯。这些化合物使感病蛇龙珠葡萄酒主要呈现花果香、奶油香气和香辛料味等香气特征。与未感病蛇龙珠葡萄酒相比，感病蛇龙珠葡萄酒中检测出了具有草药香的异戊酸香叶酯，色谱分析表明其出峰时间在35～40 min。

表6 葡萄酒香气嗅闻分析结果Tab.6 Results of olfactory analysis of wine aroma

2.6 香气重构和缺失实验结果

香气强度和OAV的分析结果确定了影响感病蛇龙珠葡萄酒香气的关键香气物质。为了进一步验证这些主要香气化合物对感病蛇龙珠葡萄酒整体香气的贡献，对原酒和重构酒进行定量描述分析。采用OAV大于1(表5)和香气强度大于3(表6)的26种香气物质进行重构分析，重构酒样由模拟溶液和26种化合物组成，具体配比见表7。感病蛇龙珠原酒与重构酒样的香气轮廓如图3。在6种香气中，中药、红色水果、淡奶油和酒精味有较强的香气强度。重构酒样与感病蛇龙珠原酒香气轮廓基本一致，但重构酒样中药和热带水果的香气强度均低于感病蛇龙珠原酒，可能是由于在GC- O分析中存在一些未被鉴定的强度较高的香气物质，而这些物质没有被添加进重构酒样中。

表7 重构酒样香气物质及质量浓度Tab.7 Aroma components and their mass concentrations of reconstituted wine

为了验证具有草药香气的异戊酸香叶酯对感病蛇龙珠葡萄酒香气轮廓的影响，以异戊酸香叶酯为缺失物质建立缺失模型。通过三角检验对比缺失与未缺失香气物质的重构酒样之间是否存在差异，来确定其对整体香气的贡献，缺失实验的结果如表8。结果表明，异戊酸香叶酯缺失组与未缺失组的重构酒样之间存在显著差异(P≤0.05)。

图3 感病蛇龙珠原酒样与重构酒样香气轮廓分析Fig.3 Aroma profile analysis of susceptible Cabernetgernischt wine and reconstitution wine

表8 感病蛇龙珠葡萄酒缺失实验结果

3 结 论

作为危害程度最严重的葡萄病毒病之一，蛇龙珠对卷叶病毒尤其敏感。本研究以宁夏贺兰山东麓显性感染卷叶病的蛇龙珠葡萄为材料，以未感病的蛇龙珠为对照，分析葡萄酒的主要理化指标和挥发性物质，并结合感官品鉴和GC- O评价了卷叶病对蛇龙珠葡萄酒香气的影响。

1)理化指标。感病蛇龙珠葡萄酒的酒精度、花色苷质量浓度显著低于未感病蛇龙珠葡萄酒，这与前人的研究结果一致[31-32]。酒精度的降低是因为卷叶病毒下调了蛇龙珠葡萄果实中与蔗糖代谢有关的基因，而糖代谢和积累是提升葡萄酒酒精度的关键过程；而花色苷质量浓度的降低主要有2个原因，一是与卷叶病毒抑制了蛇龙珠葡萄果实中苯丙氨酸途径的基因有关，因为苯丙氨酸途径处于花色苷合成的第一阶段[33]，二是卷叶病毒抑制了成熟时蛇龙珠葡萄果实中的类黄酮糖基转移酶基因的表达，该酶是花色苷合成途径的限速酶，它可以使不稳定的花色苷转变成稳定的花色苷[34]。

2)感官分析。感病蛇龙珠葡萄酒与未感病蛇龙珠葡萄酒相比，其突出的香气特征是具有中药香气，并且花果香气和生青气味明显降低。香气物质分析结果表明，感病蛇龙珠葡萄酒中与花果香以及生青气味相关的香气化合物的质量浓度显著降低，与油脂味相关的香气化合物的质量浓度显著提高，如具有脂肪气味特征的月桂酸异戊酯、棕榈酸乙酯，具有淡奶油香气的正癸醇和具有黄油气味的2,3-戊二酮，该结果与感官品评结果具有部分一致性。通过GC- O- MS分析，在感病蛇龙珠葡萄酒中发现了具有草药香气特征的异戊酸香叶酯。通过重构和缺失实验证实了异戊酸香叶酯能够影响感病蛇龙珠葡萄酒的中药香气特征。感病蛇龙珠葡萄酒的各项理化指标均符合标准，香气的优雅度、协调性以及总体得分与未感病蛇龙珠葡萄酒没有显著差别，故感病蛇龙珠原料仍保持该品种的酿酒学特性。