威宁地区茶树种质资源的抗旱性研究

刘 燕，罗文敏，段如雁，李 芸，杨秀忠

(1. 贵州省生物研究所, 贵阳 550009；2. 威宁自治县山地特色农业科学研究所，贵州 威宁 553100)

【研究意义】威宁县地处贵州省西部，属于高海拔高寒地区，该地气候温和，冬无严寒、夏无酷暑，有利于茶叶有机物的合成和积累[1]，产出的茶叶氨基酸、咖啡碱、黄酮、维生素和芳香类物质含量均高于低山地区[2]。生长在海拔1900～2200 m的威宁高山茶，因其香味浓厚、回味甘甜、经久耐泡和独特的“豆香味”而深受人们喜爱。但威宁县春季降水偏少[2]，平均月雨量低于150 mm，春季干旱严重抑制了幼林茶树生长，影响了威宁高山茶的产量和品质，减少了茶农的经济收入。因此，选择抗旱性强的茶树品种对威宁地区茶产业的健康发展有积极的促进作用。【前人研究进展】叶片的显微结构是茶树生长发育过程一系列生理活动基础，与茶树的分类、遗传和抗逆性等具有密切关系[3]。黎钊等[3]研究发现，叶片较厚的茶树品种比叶片较薄的茶树抗旱性强，表皮厚度大的茶树品种比表皮厚度小的抗旱性强。杨凤等[4]则指出，叶片栅栏组织层数多、栅海比(栅栏组织/海绵组织)高的茶树比栅栏组织层数少、栅海比小的茶树抗旱性强[4]。除了叶片解剖结构的改变外，茶树在生理生化上也会对干旱产生积极响应[5]。茶树可通过提高自身调节渗透能力、改变保护酶活性等生理活动来适应干旱[6-7]。【本研究切入点】植物的抗旱性受多种因素影响。前人对茶树种质资源抗旱性评价大多采用单个指标进行分析，对数据综合考量较少[8]，单个指标评定植物抗旱性容易造成的数据的孤断性。采用多项指标对植物抗旱性进行综合评价，评定结果与实际情况更加接近[9]。隶属函数法可结合多项测定指标，对材料特性进行综合评价，克服单一研究指标的不足[8]。【拟解决的关键问题】以威宁县茶产区收集到的9份茶树种质资源为试验材料，对其进行叶片解剖结构观察、抗氧化酶活性和渗透调节物质的测定，探究其在叶片解剖结构和生理上的差异，并通过模糊隶属函数法对其进行抗旱性综合评价，以期找出适合威宁地区种植的茶树品种，为威宁高山茶产业的发展奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

茶叶种质资源共9份，来源于贵州省毕节市威宁县茶产区，分别是黄金芽、云南大叶茶、鸠坑小叶种、福鼎大白茶、安吉白茶、银霜、茗科1号、威宁老茶树、龙井43。种质资源种植于威宁香炉山茶园公司的草海西码头茶叶种植基地内(25°35′11″N，104°25′30″E)。种植规格为行距1.6 m，丛距0.6 m，株距0.25 m，双行条栽，每丛3株。每个品种种植500株以上，茶苗均为2年生扦插苗，基地生长环境及人工管理一致。采摘连续10 d未浇水或未受到雨水灌溉的茶苗叶片进行相关分析测定。

1.2 方法

1.2.1 石蜡切片制作与观察 随机选取各茶树第2～3节位成熟叶，用徕卡刀片沿叶片主脉中部横切成0.5 cm×0.5 cm的小块；放入福尔马林—醋酸—酒精(FAA)固定液中固定、抽气。系列酒精脱水各2 h，二甲苯透明，石蜡包埋，徕卡RM2016切片机切片，切片厚度为8～10 μm，番红—固绿双重染色，中性树胶封片[10]。采用日本尼康显微镜(Eclipse E100)观察解剖结构，用尼康自带拍照软件(NiknoDS-U3)拍照，并利用Image-pro plus 6.0软件进行叶片厚度、栅栏组织厚度等指标测定。

1.2.2 抗氧化酶活性测定 随机选取各茶树相同部位成熟叶片，用蒸馏水清洗，吸干水分，将叶片剪碎，称取约0.1 g叶片，加入1 mL磷酸缓冲液(pH 7.5)进行冰浴匀浆。4 ℃ 8000 r/min离心 10 min，取上清液置冰上待测。参照超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒使用说明书操作在酶标仪上测定SOD、POD和CAT值。

1.2.3 渗透调节物质测定 称取0.1 g各茶树叶片样品，加入5 mL 3%磺基水杨酸，均质化后过滤。取2 mL滤液加入2 mL酸性茚三酮试剂和2 mL冰醋酸，混合均匀，100 ℃下加热反应1 h，而后在冰上冷却20 min，放入4 mL甲苯，冷却至室温。采用分光光度计法在520 nm测量脯氨酸吸光度值。可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[11]。

1.2.4 抗旱性指标评价 采用模糊隶属函数值法对9份茶树种质资源的抗旱性进行综合评价[12]。抗旱隶属值的计算公式如下。

(1)

(2)

1.3 数据分析

用SPSS 18.0 进行单因素方差分析，采用LSD法进行多重比较，显著水平设置为α= 0.05，用Microsoft excel 2007进行隶属函数分析，相关图表制作在Origin pro 8中完成。

2 结果与分析

2.1 不同茶树品种的叶片解剖结构

根据不同茶树品种叶片的解剖结构特征(表1，图1)，9个茶树品种在叶片厚度、栅栏组织和海绵组织厚度、上下表皮厚度、栅栏组织和海绵组织密度、海绵组织层数和栅栏组织层及数栅/海比上都存在差异。9个茶树品种中，叶片厚度、栅栏组织厚度和栅/海比以鸠坑小叶种的最大，其次是威宁老茶树和福鼎大白茶，黄金芽和云南大叶茶最小。

表1 不同茶树叶解剖结构特征

1～9分别为黄金芽、云南大叶茶、鸠坑小叶种、福鼎大白茶、安吉白茶 、龙井43、银霜 、茗科1号和威宁老茶树Numbers of 1-9 were the Golden bud tea，Yunnan large leaf tea，Jiukeng small leaf tea，Fuding white tea，Anji white tea，Longjing tea 43，Yinshuang tea, Mingke tea 1 and Weining old tea图1 不同茶树品种叶片的解剖结构特征Fig.1 Anatomical structure of leaves of different tea cultivars

2.2 不同茶树品种的抗氧化酶活性

9个茶树品种间叶片抗氧化酶活性存在一定差异(图2)。其中，鸠坑小叶种、福鼎大白茶、威宁老茶树的SOD含量最高，3个品种间差异不显著，但与黄金芽、云南大叶茶、安吉白茶、银霜、茗科1号间差异显著(P<0.05)，黄金芽中SOD含量最低，除与云南大叶茶差异不显著外，与其他7个茶树差异显著(P<0.05)。黄金芽、安吉白茶和龙井43的POD含量最低，3个品种间无显著性差异，但与其他6个茶树间差异显著(P<0.05)；云南大叶茶、鸠坑小叶种、福鼎大白茶、银霜、茗科1号和威宁老茶树的POD含量略有不同，但6个茶树间无显著性差异。鸠坑小叶种、福鼎大白和威宁老茶树CAT含量最高，三者无显著性差异，但与其他6个茶树差异显著(P<0.05)；黄金芽、安吉白茶和银霜的CAT含量最低。

不同小写字母表示差异达显著性水平(P<0.05)，下同Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05 level. The same as below图2 不同茶树品种的抗氧化酶活性Fig.2 Analysis of antioxidant enzyme content in different tea cultivars

2.3 不同茶树品种的渗透调节物质

从图3看出，9个茶树品种间叶片渗透调节物质含量存在差异性。脯氨酸含量以鸠坑小叶种、福鼎大白茶和威宁老茶树的最高，三者间差异不显著，与云南大叶茶、安吉白茶、龙井43和茗科1号间均无显著性差异；黄金芽脯氨酸含量最低，与云南大叶茶和银霜无显著性差异，但与其他6个品种间差异显著(P<0.05)。可溶性蛋白含量以福鼎大白茶的最高，与鸠坑小叶和威宁老茶树无显著性差异，与其他茶树品种间差异显著(P<0.05)；黄金芽含量最低，与其他8个茶树品种间差异显著(P<0.05)。

图3 不同茶树品种的渗透调节物质含量Fig.3 Osmotic adjustment substances in different tea cultivars

可溶性糖含量以鸠坑小叶最高，与其他8个茶树品种间差异显著(P<0.05)，黄金芽含量最低，与其他8个茶树差异显著(P<0.05)。

2.4 不同茶树品种抗旱性综合评价

对各指标进行相关性分析，去除相关性较弱的指标，余下叶片厚度、栅栏组织厚度、栅/海、SOD、CAT、POD、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白作为隶属函数综合评价指标，得到综合评价表(表2)。由综合评价得出的抗旱性为鸠坑小叶种>威宁老茶树>福鼎大白>茗科1号>银霜>安吉大白茶>龙井43>云南大叶茶>黄金芽。根据抗旱性等级评价的方法[13]，对9个茶树品种进行抗旱等级划分，综合评价均值为0.49，综合评价值高于0.59的为强抗旱品种，包括鸠坑小叶、福鼎大白和威宁老茶树；综合值在0.39～0.59的为中抗旱品种，包括茗科1号和银霜；综合值小于0.39的弱抗旱品种，包括安吉白茶、龙井43、云南大叶茶和黄金芽。

表2 不同茶树隶属函数值及抗旱性综合评价

3 讨 论

植物叶片是植物进行光合作用的场所，它的显微结构受植物生长发育过程一系列生理活动的影响，与植物的分类和遗传有密切联系[3]。黎钊[3]、杨凤[4]等研究表明，茶树叶片的解剖结构与茶树的抗旱性有一定的相关性，叶片厚度越大的茶树比叶片厚度小的茶树抗旱性强，栅/海比大的茶树比栅/海比度小的抗旱性强。白重炎等[14]研究指出，上表皮厚度、栅栏组织厚度可作为品种间抗旱性指标。本研究中，9个茶树品种在叶片厚度、栅栏组织和海绵组织厚度、海绵组织和海绵组织密度和栅/海比上表现出一定的差异性，鸠坑小叶种、威宁老茶树和福鼎大白茶的叶片总厚度、栅栏组织厚度和栅/海比上在9个茶树品种中值最大，黄金芽和云南大叶茶的叶片厚度、栅栏组织厚度和栅/海比最小，表明茶树间抗旱性存在明显的遗传差异，鸠坑小叶种、威宁老茶树和福鼎大白茶在解剖结构上表现出对干旱积极响应。

当植物遭受干旱胁迫时，细胞自由基浓度会迅速增加，细胞透性增大，引起蛋白质变性，细胞受损严重[15]。植物体内自由基的清除，主要依赖于SOD、CAT和POD组成的酶保护系统[14]。本研究中，鸠坑小叶种、威宁老茶树和福鼎大白的SOD、POD和CAT活性较高，黄金芽和云南大叶茶的SOD、POD和CAT活性较低，表明鸠坑小叶种、威宁老茶树和福鼎大白茶对干旱胁迫造成的活性氧清除要强于其他茶树，这与林郑和等人[16]结果相似。

干旱引起细胞失水，细胞渗透压降低，引起胞内物质外渗，原生质体结构遭到破坏[15]。渗透调节物质增加了植物细胞溶质浓度，降低细胞渗透势，维持较高的渗透压，缓解了脱水胁迫带来的伤害，有利于细胞水分的保持和细胞各种生理过程的维持，从而对酶、抗逆性蛋白和生物膜起保护作用[17]。脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白是植物体内常见的渗透调节物质。本研究中，鸠坑小叶种、威宁老茶树和福鼎大白茶的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于其他茶树品种，表明3种茶树遇到干旱时能有效调节细胞中渗透调节物质，有效缓解干旱胁迫造成的细胞失水伤害，保证了茶树的正常生长。

植物耐旱性性状受多种基因共同调控，分析单个指标无法全面反映植物对干旱胁迫的耐受性[8-12]。利用模糊隶属函数值法可以综合评价茶树品种的抗旱性，准确性高。本试验利用隶属函数值法综合评价了9个茶树品种抗旱性，并根据抗旱性等级评价的方法对9个茶树品种进行了等级分类，其中鸠坑小叶、福鼎大白、威宁老茶树归为强抗旱品种，茗科1号、银霜归为中等抗旱品种，安吉白茶、龙井43、云南大叶茶和黄金芽归为弱抗旱品种，与生理试验结果一致。

4 结 论

茶树抗旱性鉴定是全面系统评价茶树种质资源和筛选优质资源最基本的内容。本研究通过对威宁县周边茶区种植的9个茶树品种的叶片解剖结构观察，抗氧化酶活性和渗透调节物质的测定，并通过模糊隶属函数法对9个茶树品种进行了抗旱性综合评价，最终筛选出抗旱性较强的3个品种，分别为鸠坑小叶种、威宁老茶树和福鼎大白茶，为威宁高山茶产抗旱品种的选择提供了试验依据。