衍生化-在线凝胶色谱净化-气相色谱-质谱法测定中毒血液中氟乙酸盐的含量

张婷,王国强

(1.中国刑事警察学院 刑事科学技术学院,沈阳 110035;2.江苏连云港市公安局刑警支队,连云港 222000)

氟乙酸盐是一类剧毒含氟杀鼠剂,属于A 级有机剧毒物质,低浓度水平即可引起人畜中毒死亡,人口服致死量为0.7～5 mg·kg－1。我国已禁止生产氟乙酸盐,并且出台了严格的管理措施,但由于其制备简单、价格低廉、灭鼠效果明显,该类鼠药还可能会在非正规市场上或者以流动人员兜售等形式出现,由此造成人、畜一次中毒和二次中毒事件时有发生,因此有必要开发一种快速、灵敏地测定生物检材中氟乙酸盐含量的方法。

氟乙酸盐中毒生物检材的测定方法主要有气相色谱法[1-2]、气相色谱-质谱法[3-4]、离子色谱法[5]、离子色谱-质谱法[6]、液相色谱法[7-8]、液相色谱-质谱法[9-12]、核磁共振法[13]。而非衍生化法的前处理方法只适用离子色谱法、离子色谱-质谱法、液相色谱法和液相色谱-质谱法分析,尽管操作过程简单,但氟乙酸根的相对分子质量小,中毒检材中含量低,且容易与生物检材中内源性组分质量数混淆,进而产生分析干扰。因此,衍生化处理后进行分析可保证结果的准确度。以往生物检材前处理先进行极性溶剂液液萃取(LLE)、离子型固相萃取(SPE)等提取净化预处理,再开始衍生化操作,但是由于氟乙酸盐水溶性强,提取和净化过程物质损失较大,基质干扰严重,前处理并衍生化操作后的灵敏度不高。衍生化反应试剂有很多,可分为酰胺类衍生化试剂和酯类衍生化试剂。其中2,4-二氯苯胺法、N,N-二乙基对苯二胺法、四丁基溴化胺催化的α-溴苯乙酮法、硫酸催化乙醇酯化法、五氟苄基溴法等均可以进行氟乙酸盐衍生化操作,卤代烷烃五氟苄基溴试剂是最为常用的衍生化试剂,使用该试剂操作简便、灵敏度较高,国内公安部门常采用[14]。鉴于此,本工作用乙腈沉淀蛋白,以Qu ECh ERS 进一步去除杂质,采用衍生化-在线凝胶色谱(GPC)净化-气相色谱-质谱法测定血液检材中氟乙酸盐的含量,以期为相关案件中氟乙酸盐含量的准确测定提供方法参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

2010ULTRA 型气相色谱-质谱联用仪;LC-20AD型在线凝胶色谱净化系统;LP微型旋涡混匀器;2-16KL型高速离心机。

氟乙酸钠标准溶液:1.0 g·L－1。

含10%(体积分数,下同)五氟苄基溴的乙腈溶液;丙酮、乙腈、环己烷均为色谱纯;盐酸、氯化钠、硫酸钠、碳酸钠均为分析纯;试验用水为二次双蒸水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 在线GPC条件

Shodex CLNpak EV-200凝胶色谱柱(10 cm×0.25 mm,0.25μm);柱温40 ℃;检测波长210 nm;流动相为体积比7∶3的丙酮-环己烷混合溶液;流量0.1 mL·min－1;进样体积20μL;样品采集时间4.06～6.06 min。

1.2.2 色谱条件

DB-35ms色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);载气为高纯氦气,纯度99.999%。大体积程序升温汽化进样口(PTV),进样口升温程序:初始温度120 ℃,保持5.0 min;以速率100 ℃·min－1升温至250 ℃,保持31.7 min。恒压模式;不分流进样。柱升温程序:初始温度82 ℃,保持5.0 min;以速率8 ℃·min－1升温至310 ℃,保持11.8 min。

1.2.3 质谱条件

电子轰击离子(EI)源,电子能量70 eV;离子源温度200 ℃,接口温度250 ℃;扫描时间10.0～40.0 min;扫描范围 质荷比(m/z)45～450;溶剂延迟时间9.5 min。

1.3 试验方法

取1 mL血样,按乙腈-血液体积比1∶1的比例加入1 mL 乙腈,混匀后涡旋3 min,以转速9 000 r·min－1离心5 min。分取上清液1.5 mL,加入6 mol·m L－1盐酸溶液100μL,调节溶液酸度至p H＜2,加入氯化钠0.3 g,使溶液过饱和,涡旋3 min,以转速9 000 r·min－1离心5 min。分取上清液1.0 mL,加入0.1 g碳酸钠、0.2 g无水硫酸钠和含10%五氟苄基溴的乙腈溶液50μL,于65℃反应1 h。反应液过0.25μm 滤膜,分取20μL 滤液,按照1.2节仪器工作条件测定。随同制备空白样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的选择

血液样品基体复杂,不仅含有蛋白质、脂肪、水、色素等杂质,还含有与氟乙酸盐极性相近的物质。为了提高样品提取和富集效果,使测定结果更准确,试验依次采用乙腈沉淀蛋白,QuECh ERS脱水、去脂,在线GPC净化去除血液提取液中与待测物极性相近的成分。

2.1.1 蛋白沉淀法

常用的蛋白沉淀法有酸沉淀法和有机溶剂沉淀法。由于氟乙酸钠在酸性条件下不稳定,试验采用乙腈沉淀、高速离心分离的方法去除蛋白质,并考察了乙腈-血液体积比分别为1∶2,1∶1,2∶1,3∶1时对50μg·L－1加标血液样品蛋白沉淀效果的影响。结果显示:乙腈-血液体积比为1∶2时,上清液浑浊,沉淀不完全;乙腈-血液体积比为1∶1和2∶1时,上清液澄清,表明沉淀较为完全,但乙腈-血液体积比2∶1时,溶液体积增大,检测灵敏度下降;体积比为3∶1时,溶液出现分层现象,回收率不佳。因此,试验选择加入与血液等体积的乙腈沉淀蛋白。

2.1.2 QuEChERS

Qu ECh ERS为食品检测领域脱水、去脂的常用方法[15-16],试验选择在去除蛋白后的样品溶液中加入碳酸钠、无水硫酸钠和氯化钠,用于吸收水分和形成盐析作用,使氟乙酸衍生化产物尽可能地溶解在有机溶剂中,进而提高氟乙酸盐的回收率。

2.1.3 在线GPC净化

利用空间排阻原理,GPC 可分离体积大小不同的分子[17],试验采用在线GPC 去除血液提取液中与待测物极性相近的成分,但是净化效果受进样体积和采样时间影响较大。因此,试验考察了空白血液提取液进样体积分别为10,20,50μL 时对GPC色谱响应的影响,结果见图1。

由图1可知:当进样体积为10μL 时,GPC 色谱响应灵敏度较低,不利于样品采集;当进样体积为20μL,响应灵敏度较好,杂质出峰更彻底;当进样体积为50μL时,色谱峰出现出峰迟滞现象,推测与色谱柱容量过载有关。因此,试验选择的进样体积为20μL。

图1 不同进样体积下空白样品溶液的GPC色谱图Fig.1 GPC chromatograms of the blank sample solution with different inject volumes

按照1.2.1节在线GPC条件分析空白样品溶液和空白加标样品溶液(加标量50μg·L－1),色谱图见图2。

结果显示:GPC色谱图按照出峰时间共有3段色谱峰。其中,2.41～3.80 min出峰的组分为血液基体,成分复杂,含有蛋白质、脂肪、色素等大分子杂质;3.80～4.16 min和4.16～5.74 min内出峰的组分为含有氟乙酸衍生化产物的待测溶液。但从图2(曲线1)中发现,空白样品溶液的GPC 色谱图也在此处有色谱峰,说明还有相对分子质量相似的小分子干扰物在这两个时间段内出现。因此,扩展并细化采样节点,3.05～5.05 min,3.74～5.04 min,4.06～6.06 min等3 个采样时间段以及未经GPC净化所得空白样品溶液的总离子流色谱图见图3。

图2 空白样品溶液和空白加标样品溶液的GPC色谱图Fig.2 GPC chromatograms of the blank sample solution and the blank spiked sample solution

由图3可知,未经GPC 净化的血液杂质最多。经GPC净化后分别于3个时间段取样,其中3.05～5.05 min涵盖了血液基质大部分杂质,色谱峰杂质并未减少;3.74～5.04 min明显看到的杂质峰减少;4.06～6.06 min的杂质最少。由此分析可知,血液中大分子杂质主要集中在3.74 min之前出峰。结合图2中氟乙酸衍生化产物的GPC出峰时间,确定最终的GPC取样时间为4.06～6.06 min。

图3 不同GPC采样时间段以及未经GPC净化所得空白样品溶液的总离子流色谱图Fig.3 Total ion chromatograms of the blank sample solutions with different GPC sampling time intervals and without GPC purification

2.2 色谱行为

样品溶液经在线GPC 净化后,无需浓缩,直接通过大体积PTV 进样分析。PTV 的进样体积可达到20μL,并能在程序升温条件下不分流进样,检出限会显著降低,适合分析沸点范围宽及热不稳定样品。在优化的试验条件下,空白样品溶液以及空白加标样品溶液(加标量50μg·L－1)的总离子流色谱图见图4。

图4 空白样品溶液和空白加标样品溶液的总离子流色谱图Fig.4 Total ion chromatograms of the blank sample solution and the blank spiked sample solution

2.3 工作曲线、检出限和测定下限

在空白样品中添加氟乙酸钠,配制成10,20,40,80,160,320μg·L－1的加标样品溶液系列,按照试验方法测定。以氟乙酸钠的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制工作曲线,所得工作曲线的线性范围为10～320μg·L－1,线性回归方程为y＝1.236x＋2.307,相关系数为0.997 9。

按照试验方法分析加标样品溶液(加标量10μg·L－1),以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),所得结果为2.9μg·L－1。

2.4 精密度和回收试验

按照试验方法对空白样品进行3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平分别于1 d内连续测定5次和连续5 d测定,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表1。

表1 精密度和回收试验结果(n=5)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n=5)

由表1 可知,氟乙酸钠的回收率为71.4%～80.5%,测定值的日内RSD 为5.1%～6.7%,日间RSD 为5.3%～7.7%,方法的准确度和精密度符合毒物分析要求[18]。

2.5 样品分析

从疑似中毒并抢救后死亡的死者身上取血样,按照试验方法分析。结果表明,血液检材中检出氟乙酸盐,检出量为0.61 mg·L－1,这与已经报道的案件中死者胆汁中氟乙酸钠质量浓度为0.2 mg·L－1[19],以及家兔口服2 mg·kg－1氟乙酸钠引起死亡时血液浓度为0.67 mg·L－1相一致,推测死者的致死原因为氟乙酸类鼠药中毒,说明该方法能满足毒物快速检测的要求。

本工作采用衍生化-在线GPC 净化-气相色谱-质谱法测定血液中氟乙酸盐的含量,该方法快速、高效,可用于低含量氟乙酸盐中毒血液的定性和定量检验。