血根碱提取工艺、生物活性及在水产养殖中应用的研究进展

汪 健，胡 毅，陈开健，钟 蕾，符贵红，石 勇

（湖南农业大学动物科技学院，湖南长沙 410128）

我国水产养殖业发展迅速，人工养殖日渐趋于规模化与集约化，水产动物易受各种病害的威胁。抗生素具有易于获得、使用方便、效果显著等多种优势，常应用于防治水产病害问题。水产动物长期使用抗生素易产生耐药性，产生的耐药菌株威胁人类公共卫生安全，同时也会破坏养殖水体的微生态。此外，随着全面禁抗实施，寻求抗生素的有效替代物迫在眉睫。

近年来，中草药在水产养殖中的应用与相关研究逐渐成为热点。中草药在水产养殖的应用中表现出多种优点，如价格低、药物残留少、无耐药性等。目前，已有多种天然的抗菌生物碱在PubMed及Science Direct公布，血根碱是其中最为有效的天然抗菌生物碱之一，在水产替抗与健康养殖的研究中颇受关注[1]。本文针对血根碱的相关研究进展展开综述，以期为血根碱作为水产饲用免疫增强剂提供参考，推动血根碱在水产养殖中的研究应用。

1 血根碱概况

血根碱（sanguinarine）多存在于博落回、白屈菜、血水草等植物中，经二氢苯并啡啶氧化酶氧化二氢血根碱形成[2]，为苯菲啶异喹啉类生物碱。血根碱分子式为C20H15O5N，相对分子质量332，熔点为265～267℃，提纯后为粉末状固体，呈红黄色，分子结构式见图1。2004年，欧盟通过了以血根碱为主要功能成分之一的饲料添加剂的注册，随后广泛应用于各国的动物生产中并取得了显著的效果[3]。2011年，国家批准血根碱为二类新兽药；2012年，以血根碱为主要成分的新型中兽药类饲料添加剂“美佑壮”也通过了国家批准。

图1 血根碱的分子结构Fig.1 Molecular structure of sanguinarine

2 血根碱提取及分离纯化工艺

2.1 血根碱的提取

2.1.1 溶剂提取法

血根碱的提取方法中最常用的是溶剂提取法。目前，对血根碱提取工艺的研究中多以博落回作为提取对象[4]。范家佑等[5]对酸水提取博落回果实中的血根碱生物碱的工艺进行了改进，结果发现，在提取温度90°C、料液比1∶50、提取时间5 h、pH值为1.5的条件下效果最好，博落回总生物碱的提取率为9.1%。范伏田等[6]采用盐酸作为溶剂对博落回中生物碱进行提取，发现在盐酸浓度为1.5%、固液比1∶18 g/mL、温度85°C、提取时间2 h的条件下提取效率较好，经过两次提取后，博落回总生物碱的提取率为80.1%。曹华亮[7]尝试了乙醇回流法和酸水渗漉法对博落回茎叶中血根碱进行提取，结果发现，在对乙醇回流法经过响应面法的优化后，当乙醇浓度90%、料液比1∶30、硫酸浓度0.12%、提取温度80℃、提取时间为2 h的条件下，茎叶中89.36%血根碱均被有效转移。

2.1.2 内部沸腾法

内部沸腾法是在低温下强化对植物的提取，相比其他传统溶剂提取法，内部沸腾法优点颇多，如提取率高、提取速度快、溶剂用量少等。有关内部沸腾法提取血根碱的工艺的研究表明，经响应面优化后确定最佳条件，可达到9.10 mg/g提取率[8-9]。

2.2 血根碱的分离纯化

2.2.1 离子交换树脂法

袁帅[10]采用离子交换树脂提取博落回中血根碱，结果显示，将博落回经酸水提取、调节至碱性条件后采用氯仿萃取，回收溶剂，得到含45.73%血根碱与白屈菜红碱的生物碱粗物质；再通过层析系统及强阳离子交换树脂精制，洗脱并收集血根碱馏分，可得到高纯度的血根碱提取物，纯度达90%以上。邓霖芳等[11]研究发现，采用软胶型弱阳离子交换树脂，经反相C18制备柱脱盐及进一步纯化，得到的血根碱纯度可达97%。

2.2.2 大孔吸附树脂法

大孔吸附树脂法能够从中草药成分中选择性地吸取有效成分。黄敬[12]和黄金红等[13]对博落回和小果博落回果实中的总生物碱进行了研究，发现不同型号的大孔吸附树脂提取纯化率存在较大差异，AD-8型树脂为最佳型号，对血根碱等生物碱具有较高的吸附率和洗脱率，在最优工艺条件下可得到纯度90%以上的博落回总生物碱提取物。

2.2.3 高速逆流色谱法

贾长青等[14]建立了一种利用高速逆流色谱法分离制备血根碱的方法，该法具备使用方便、成本低、产量大等优点；在优选条件下，能够从粗制博落回生物碱中分离出50.5%的高纯度血根碱盐酸盐。

3 血根碱的生物学功能

3.1 抗菌作用

血根碱的抗菌作用主要有两种途径：血根碱能够抑制细菌分裂，阻止细菌Z环形成，并对丝状温度敏感蛋白FtsZ的装配产生干扰；血根碱还能够诱导膜结合细胞壁自溶酶释放，使细菌自身发生溶解[15]。王静慧等[16]在体外研究了血根碱的抗菌作用，发现血根碱能够有效地清除病原菌的生物被膜，进而抑制病原菌生长繁殖。研究表明，血根碱对多种有害菌均具有抑制效果，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等[17-18]，为解决水产动物生产中的有害菌问题提供了思路。

3.2 抗寄生虫作用

血根碱具有良好的抗寄生虫作用。Wang等[19]研究发现，血根碱对指环虫的杀虫效果显著，0.37 mg/L浓度的血根碱即可杀灭鲫鱼鱼体内半数的指环虫；浓度为0.70 mg/L时可完全杀灭鱼体内指环虫，与芦程[20]研究结果一致，其杀灭寄生虫的机制是血根碱对指环虫体表结构和抗氧化酶系统造成了一定破坏，同时也提升了鱼体的免疫能力。Zhang等[21]研究发现，血根碱能够有效防治血吸虫，3.68μg/mL浓度的血根碱可完全杀灭血吸虫。Huang等[22]在针对抗旋毛虫的研究中发现，血根碱可使机体肠道杯状细胞数量及活性氧自由基含量增加，进而达到加快虫体的排出的效果。

3.3 抗炎功能

当动物机体面临外界刺激，其自身的免疫系统会产生一定的防御性反应，即产生了炎症。血根碱抗炎作用的机制是由于对核转录因子-κB（NF-κB）产生了抑制，导致炎症因子表达下调。NF-κB能够调控200个以上基因的表达，许多炎症引起的疾病均与NF-κB的活性密切相关[23]。NF-κB在通常情况下以一种异质三联体的复合物形式存在，包括p50、p65、IκB-α，活性较为稳定。当外界刺激激活NF-κB时，其中的IκB-α发生磷酸化、泛素化，最后降解，并将p50-p65异质二聚体从细胞质中转移至细胞核内，影响炎症相关基因表达，导致炎症因子的上调及机体产生炎症。血根碱可对NF-κB的活化途径产生抑制，减轻动物机体的炎症[24]。Khadem等[25]对鼠进行了体外试验，采用脂多糖（LPS）诱导鼠巨噬细胞产生炎症，结果表明，以血根碱为主要功能成分的博落回提取物抗炎作用与抗生素相似。Kantas等[26]在断奶仔猪日粮中添加了含血根碱的饲料添加剂，发现断奶仔猪的血清中的炎症指标显著下降。

3.4 抗氧化功能

需氧生物可产生一种活性氧自由基（ROS），当机体处于稳定状况下，ROS含量会保持动态平衡，促进细胞及组织的生长发育。适量的ROS能够促进细胞的增殖分裂，而过量的ROS则会抑制细胞正常生长，引起机体多种氧化损伤，诱发多种疾病，持续的DNA损伤甚至会导致癌症产生[27-29]。研究表明，以血根碱为代表的一些天然抗氧化剂可减缓过量的ROS对机体造成的负面作用，能够清除ROS，还可以避免蛋白质氧化损伤和羰基化损伤，抑制脂质及DNA氧化损伤[30-33]。Varga等[34]研究发现，血根碱对佛波醇诱导的氧化裂解有抑制作用，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶复合物在此过程中起到重要作用。血根碱的抗氧化机制可能是对NADPH氧化酶的活性产生抑制，Qin等[35]在研究中也得到了相似的结果。Liu等[36]采用血管紧张素（an-giotensinⅡ，AngⅡ）构建了过量的ROS模型，并研究了血根碱对该模型的作用；结果表明，机体中ROS显著降低，可能是由于血根碱抑制了NADPH氧化酶活性所致。

3.5 保护肝脏

以血根碱为主要功能成分的博落回提取物（MEC）对急性肝损伤具有一定的保护作用，能够提高机体免疫力，提高B淋巴细胞和T淋巴细胞的免疫性能。此外，MEC还可对肝脏纤维化进程产生抑制作用，进而达到保护肝脏的效果，表现为血清乳酸脱氢酶（LDH）降低及白蛋白/球蛋白（A/G）比值升高。有研究采用血吸虫构建了小鼠肝脏的纤维化模型，结果表明，MEC显著改善了小鼠肝脏功能，猜测可能存在多方面原因，如对肝细胞膜的保护、抗氧化能力的提高、肝脏炎症的减轻等[37-38]，与杨军衡等[39]结论一致。

3.6 改善肠道健康

肠道健康与机体的多种功能密切相关，肠道能够调控机体的营养代谢及免疫功能，影响动物的生长发育和健康水平。肠道健康程度可从多个方面判断，包括对营养物质的消化吸收、肠道屏障功能、肠道微生物及肠道免疫功能等。已有诸多试验证明，以血根碱为主要功能成分的博落回提取物具有多种改善肠道健康的作用：强化对营养物质的消化吸收能力，表现为促进小肠绒毛发育，增加肠绒毛表面积；促进肠道黏膜屏障，肠道紧密连接蛋白表达水平上升；调节肠道微生物菌群结构，抑制大肠杆菌等有害菌生长繁殖；提高肠道免疫功能，表现为小肠黏膜免疫球蛋白水平升高[40-42]。

3.7 抗癌

血根碱的抗癌作用表现为对癌细胞生长上的抑制及对其凋零的诱导，作用机制主要包括：使癌细胞产生了游离氧自由基及引起内质网（ER）应激，对磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）及蛋白激酶B（Akt）两条信号通路产生抑制，使癌细胞发生凋亡[43-45]。张鸿[46]研究了血根碱对人体癌细胞的影响，发现血根碱对人胃癌细胞和肝癌细胞具有显著的抑制作用，且抑制作用与血根碱的浓度及作用时间呈正相关。有研究发现，血根碱对前列腺癌细胞也具有一定的抑制性，表现为DNA损伤增加、细胞凋亡改变，诱导细胞周期蛋白激酶抑制剂p21Waf1/Cip1和p27Kip1生成，但其抑制效果与剂量密切相关[47]。此外，血根碱能够干扰微管的组装进而阻碍癌细胞增殖，起到抑制宫颈癌的作用。有研究发现，过量的促分裂原活化蛋白激酶（MKP-1）对由DNA断裂剂和细胞应激引起的细胞凋亡具有保护作用，血根碱能够抑制MKP-1的活性，使癌细胞不再受MKP-1的保护而凋亡，进而起到一定的抗癌作用[48-49]。

3.8 对生殖系统的作用

Bianco等[50]研究表明，血根碱对雌二醇的生成具有一定程度的抑制作用，但对黄体酮的生成和卵泡细胞增殖影响较小；血根碱对卵巢颗粒细胞血管内皮生长因子（VEGF）产生存在抑制作用，在一定程度上提升了抗氧化能力。Chan[51]研究发现，血根碱对鼠生殖系统存在一定的抑制作用，表现为鼠囊胚细胞的发生凋亡，胚胎着床受阻，抑制卵母细胞成熟，影响胚胎的正常发育。陶霖等[52]研究发现，在对患有输卵管炎症的蛋鸡投喂低剂量血根碱药饵后，蛋鸡病症得到了显著改善。综上所述，血根碱对动物的生殖系统发育具有一定的负面作用，在利用血根碱多种优良功能的同时，也不可忽视其存在的不良影响。

4 血根碱在水产动物中的应用

4.1 促进生长发育

Korkut等[53]研究发现，在饵料中添加50 mg/kg以血根碱和白屈菜红碱为主要功能成分的饵料添加剂能够显著提高鲈鱼的生长性能。Rawling等[54]在红罗非鱼饵料中添加了血根碱及白屈菜红碱，结果显示，血根碱及白屈菜红碱处理组的红罗非鱼生长性能显著增加，包括摄食量、增重率、特定生长率等指标，而体组成和肝脏功能与对照组相比差异不显著。

4.2 提高肌肉品质

罗来婷等[55]、陈贞年等[56]在中华鳖饵料中分别添加了0、50、100、150mg/kg的血根碱制剂，饲养75 d后对中华鳖的生长性能、免疫能力及肌肉品质等指标进行检测。结果表明，血根碱显著提高了中华鳖存活率和机体抗氧化能力，改善了肌肉品质，优化了肠道菌群结构，并对肝脏起到一定保护作用。在添加50mg/kg血根碱的处理组中，中华鳖肌肉中总氨基酸及鲜味氨基酸的含量均具有一定程度的提高。综合各项指标可知，中华鳖饵料中的最适添加量为50～100 mg/kg。

4.3 改善健康及增强抗病能力

Zhang等[57]研究了血根碱对锦鲤免疫能力、消化性能及肠道微生物组成的影响，结果显示，试验组锦鲤血液中非特异性免疫及抗氧化指标显著上升，肠道肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1（IL-1β）的基因表达水平显著降低，肠道微生物的丰富度显著增加。此外，采用嗜水气单胞菌对锦鲤进行攻毒后发现，血根碱组的锦鲤存活率明显上升，说明血根碱能够在一定程度上提高锦鲤对嗜水气单胞菌的抗病力。

Imanpoor等[58]研究发现，在饵料中添加博落回散（主要功能成分为血根碱和白屈菜红碱）后，鲤鱼的增重率和特定生长等生长指标均显著提升，肠道微生物中大肠杆菌等有害菌数量显著降低；以嗜水气单胞菌对鲤鱼进行攻毒试验后，饵料中添加了博落回散的鲤鱼存活率显著高于对照组。

陈团[59]分别在草鱼高棉粕菜粕饵料和低蛋白饵料中添加了0、200、400、800 mg/kg血根碱，对草鱼生长性能、免疫水平、肠道结构及微生物多样性的影响进行了研究；结果发现，在高棉粕饵料中添加了800 mg/kg血根碱的试验组草鱼生长性能、消化能力及肌肉品质均显著提高，MnSOD、IL-1、occludin基因表达水平显著上升；肠道绒毛高度及隐窝深度增加，肠道消化吸收能力增强，肠道微菌群结构得到改善。

Zhang等[60]研究表明，血根碱可提高鲫鱼机体的免疫及抗病能力，体现为鳃、肾、脾脏等组织中的多个白细胞介素及肿瘤坏死因子表达水平显著下调，趋化因子-1（CCL-1）在鱼鳃中的表达下降，在肾和脾脏表达上升，转化生长因子-β（TGF-β）的表达水平显著上升。Bussabong等[61]研究发现，富含血根碱的博落回提取物显著增强了试验对虾的抗炎和抗菌活性，提升对虾机体的健康度和成活率。石勇等[62]在黄鳝饵料中添加750μg/kg血根碱，投喂8 w后通过腹腔注射脂多糖（LPS）诱导黄鳝产生免疫应激及炎症反应；结果表明，血根碱能够有效抑制由LPS诱导的多种负面作用，改善机体健康。

综上所述，血根碱在水产养殖中能够起到许多积极作用，如杀灭寄生虫、促进生长、促进消化吸收、改善肉质、提高免疫抗病能力、改善免疫应激及炎症等，在水产养殖的发展中前景广阔[63]。

5 结论

随着水产饲用端禁抗和替抗工作的进行，血根碱等中草药受到了学术界和市场的一致青睐。血根碱除具有抗炎抗菌的作用外，还具有许多抗生素所不具备的功能，如促进摄食、提升肌肉品质、保护肝肠等，具有广阔的应用前景。目前，中草药在水产养殖中仍存在诸多问题，应重视基础研究，进一步探索其作用机制，加快推进血根碱等中草药的科学应用，促进我国水产养殖业的健康持续发展。