两种挥发性拟除虫菊酯杀虫剂对伊蚊的驱避作用研究

周巧玲，徐展益，鄢 茹，朱国念，陈梦丽

（1.浙江大学农药与环境毒理研究所，杭州 310058；2.浙江农林大学农业与食品科学学院，杭州 311300）

蚊子是黄热病、疟疾和登革热等传染性疾病传播的媒介，登革热是我国较严重的蚊子传染性疾病，2014年广东省登革热病例超45000例，是登革热发生的高峰年[1,2]。埃及伊蚊Aedesaegypti和白纹伊蚊Aedesalbopictus是登革热的主要传播媒介，我国埃及伊蚊主要分布在广东、广西、台湾、西双版纳和海南等北纬 22°以南沿海区域[1]，白纹伊蚊的分布则更为广泛，北至辽宁省，南至海南省，西至西藏自治区，分界线从辽宁一路向西，穿过河北、山西、陕西、甘肃省，到达四川省，再折向西南至西藏南部[3,4]。

防治传染性疾病最有效的手段是控制疾病传播的载体。在非洲，杀虫剂是控制疾病传染媒介的主要手段，包括杀虫剂室内喷雾（IRS）、杀虫剂处理蚊帐（ITN）和长期杀虫剂处理蚊帐（LLINs）等方法[5]。我国主要用蚊香片和电蚊香液防止被蚊子叮咬，拟除虫菊酯杀虫剂是市场上几乎所有灭蚊产品的主要成分。拟除虫菊酯杀虫剂的作用靶标是昆虫钠离子通道，随着拟除虫菊酯杀虫剂的广泛使用，钠离子通道发生氨基酸突变，即kdr突变，导致害虫对拟除虫菊酯杀虫剂的敏感性降低，拟除虫菊酯的防效变差。拟除虫菊酯杀虫剂抑制钠离子通道失活，延长钠通道开放，引起神经细胞重复开放，最终导致害虫麻痹、死亡[6]。

除杀虫剂外，驱避剂在防止蚊虫叮咬方面也具有重要作用，其中DEET（避蚊胺）是使用最广泛的驱避剂。DEET作用于蚊子嗅觉系统，从而产生驱避作用[7,8]。文献报道，拟除虫菊酯杀虫剂不仅对蚊子具有杀虫活性，同时也具有很强的驱避作用[9-12]，其中四氟苯菊酯和甲氧苄呋菊酯蒸气压低，挥发性高，驱避作用比其他拟除虫菊酯杀虫剂更为明显[12,13]。目前，对拟除虫菊酯杀虫剂驱避作用的研究只是涉及行为学观察，对其机理的研究尚在起步阶段。Yang等[14]发现四氟苯菊酯和氯氟醚菊酯能够刺激埃及伊蚊产生EAG信号。但其他蚊子是否也能识别拟除虫菊酯杀虫剂，并产生 EAG信号；其他拟除虫菊酯杀虫剂是否也能促使蚊子产生 EAG信号，尚未可知，需进一步研究。本文以白纹伊蚊和埃及伊蚊为研究对象，研究蚊香主要成分氯氟醚菊酯和四氟甲醚菊酯的驱避作用，初步探索驱避作用机理。

1 材料和方法

1.1 供试昆虫

敏感白纹伊蚊品系由浙江省疾控中心提供，采自四川省，于实验室中饲养 15年，未接触任何农药。埃及伊蚊购自BEI资源库，敏感品系为Black Eye Liverpool，抗性品系为Puerto Rico。实验室饲养条件为温度（27±1）℃，相对湿度70%±10%，光周期14L∶10D，幼虫以鼠粮为食，成虫以10%蔗糖溶液为食，雌蚊产卵前饲喂小白鼠血。

1.2 供试化合物及其配制

97.3%氯氰菊酯、97.7%四氟甲醚菊酯、98.4%四氟苯菊酯、99.1%氯氟醚菊酯和 99.7%联苯菊酯均购自德国 LGC公司；99%DEET（避蚊胺）购自上海麦克林生化科技有限公司。驱避试验中，将供试化合物标样用丙酮分别配置成10-2、10-3和10-4mol/L浓度梯度的溶液，以丙酮为空白对照。EAG试验中，将供试化合物标样用正己烷分别配置成10-1、10-2和10-3mol/L浓度梯度的溶液，以正己烷为空白对照。

1.3 驱避行为试验

驱避试验由Boyle等[15]方法改进而来。挑选40头羽化后4～9 d未吸血雌蚊，转移到30 cm×30 cm×30 cm的养蚊笼中，饥饿处理24 h。将500 μL药液均匀地滴在7 cm×6 cm长方形尼龙网上，室温干燥5 min，挥发丙酮。在橡胶手套上剪一个6 cm×5 cm的开口，以挥发人体气味，在手套上固定3个磁力框架，在磁力框架之间放置两层尼龙网，下层为药液处理的尼龙网，上层为干净的尼龙网，保证蚊子喙不会接触到皮肤和药。试验前用清水洗净双手，带上橡胶手套，先用溶剂对照进行试验，记录2～5 min内落到手背方形框上的蚊子数量（一只蚊子在手套窗口停留时间超过5 s即为1次）。每次试验结束后间隔1 h，使蚊子完全恢复，然后进行处理组试验。同一化合物同一浓度测试3批蚊子，每批蚊子设置3个重复。

1.4 触角电位（EAG）测定

触角电位仪由荷兰Syntech公司的智能化数据获取控制器（IDAC-4）、刺激气流控制器（Syntech CS-55）、微动操作仪（Syntech MN-151）及Syntech 软件处理系统四部分组成。测试方法由Boyle等[15]改进而来。测试时用锋利刀片切下雌蚊的头部，并去除触角尖端。然后将头部和触角分别与参考电极和记录电极上的玻璃针（玻璃针内部充满0.1% KCl和0.5% PVP）相连。取20 μL待测试样品溶液滴在定性滤纸（2 cm×0.5 cm）上，加药后挥发30 s，用干净的镊子将滤纸条塞进干净的巴斯德管中，然后将样品管末端与气体刺激装置连接，待基线平稳后给予刺激。持续气流流速为20 mL/s，刺激气流流速为2 mL/s，刺激时间0.5 s，两次刺激间隔30 s。先用正己烷测试，然后每个化合物由低浓度到高浓度进行测试，重复3批蚊子，每批蚊子至少取20头羽化后4～9 d未吸血的雌蚊进行测试。

1.5 数据统计与分析

数据的统计分析及作图采用GraphPad Primse 8.0软件。显著性差异分析采用One-Way ANOVA-Fisher中的LSD方法，所有数据均为三个生物学重复的平均值±标准误（Means±SE），显著性检测水平为P＜0.05。驱避率计算方法如下，驱避百分数（%）＝[1—（2～5 min内化合物处理组落到手上的蚊子数量总和/2～5 min内溶剂对照组落到手上的蚊子数量总和）]×100。

2 结果与分析

2.1 拟除虫菊酯杀虫剂对白纹伊蚊和埃及伊蚊的驱避行为反应

本研究通过驱避行为试验研究拟除虫菊酯杀虫剂四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯对埃及伊蚊和白纹伊蚊的驱避行为，如图1和图2所示，与阳性对照DEET一致，四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯对白纹伊蚊和埃及伊蚊具有明显的驱避作用。DEET、四氟甲醚菊酯、氯氟醚菊酯对白纹伊蚊和埃及伊蚊的驱避作用具有剂量效应关系，且浓度10-2mol/L时，驱避率均在90%左右（图1和图2），可见，四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯是与DEET驱避效力相当的驱避剂。

图1 四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯对白纹伊蚊具有非接触驱避作用Fig.1 Dimefluthrin and meperfluthrin elicit spatial repellency in Ae.albopictus

图2 四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯对埃及伊蚊具有非接触驱避作用Fig.2 Dimefluthrin and meperfluthrin elicit spatial repellency in Ae.aegypti

2.2 白纹伊蚊和埃及伊蚊对拟除虫菊酯杀虫剂的EAG反应

研究表明驱避剂DEET主要通过嗅觉系统对蚊子起驱避作用[16]，为了探索拟除虫菊酯杀虫剂对蚊子的驱避作用是否与DEET一样，由嗅觉系统引起，本文测定白纹伊蚊和埃及伊蚊触角对拟除虫菊酯杀虫剂的EAG反应。结果表明，两种蚊子触角都对DEET具有明显的EAG响应，四氟甲醚菊酯产生微弱的EAG反应，而氯氟醚菊酯则完全没有EAG反应。此外，本文还检测了两种伊蚊对其他3种常见的拟除虫菊酯杀虫剂氯氰菊酯、联苯菊酯、四氟苯菊酯的EAG响应，结果表明其他拟除虫菊酯杀虫剂均无明显的EAG反应（图3，4）。

图3 白纹伊蚊对拟除虫菊酯杀虫剂的EAG响应Fig.3 EAG responses of female Ae.albopictus to pyrethroids

图4 埃及伊蚊对拟除虫菊酯杀虫剂的EAG响应Fig.4 EAG responses of female Ae.aegypti to pyrethroids

2.3 拟除虫菊酯杀虫剂对埃及伊蚊抗性品系的驱避行为反应

白纹伊蚊和埃及伊蚊对四氟甲醚菊酯具有微弱EAG反应，而对氯氟醚菊酯没有EAG反应，但是这两种拟除虫菊酯杀虫剂对白纹伊蚊和埃及伊蚊却有非常强的驱避作用，表明除了嗅觉系统外，很可能有其他的靶标参与了驱避作用。本文进一步检测拟除虫菊酯杀虫剂对携带有钠离子通道kdr突变的抗性埃及伊蚊的驱避作用，结果表明DEET、四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯对抗性埃及伊蚊的驱避作用呈现浓度剂量效应关系，且DEET对敏感和抗性埃及伊蚊的驱避作用无显著性差异，而四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯对抗性埃及伊蚊的驱避作用都比敏感埃及伊蚊弱，差异显著（图5）。

图5 四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯对抗性埃及伊蚊的非接触驱避作用Fig.5 Spatial repellency of dimefluthrin and meperfluthrin against pyrethroid resistant Ae.aegypti

本文测试了白纹伊蚊和埃及伊蚊对10 mg拟除虫菊酯杀虫剂的EAG反应，对氯氟醚菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、四氟苯菊酯均无明显EAG反应（图6）。

图6 白纹伊纹和埃及伊蚊对拟除虫菊酯杀虫剂的EAG响应Fig.6 EAG responses of female Ae.albopictus and Ae.aegypti to pyrethroids

3 讨论

蚊子驱避剂的研究主要集中在DEET，而对其他驱避剂的机理研究较少。2013年，Kain等[17]在Nature上发表文章表明物种间保守性很高的Ir40a是DEET的靶标嗅觉受体，然而后续通过CRISPR敲除技术构建Ir40a基因敲除果蝇，发现Ir40a基因敲除果蝇对DEET的驱避作用并没有减弱，因此重新修正结果[18]。Xu等[16]结合双电极电压钳技术和RNA干扰技术，发现蚊子驱避剂DEET作用于库蚊嗅觉受体OR136，从而实现驱避作用，但是在其他蚊虫品系中没有发现库蚊OR136的同源嗅觉受体，因此DEET的靶标受体还需进一步考证，但是毋庸置疑DEET作用于嗅觉系统而对蚊子产生驱避作用。

拟除虫菊酯杀虫剂对蚊子的驱避作用有接触驱避作用[19,20]和非接触驱避作用[21-23]，本研究发现氯氟醚菊酯和四氟甲醚菊酯对白纹伊蚊和埃及伊蚊具有非接触驱避作用。埃及伊蚊Puerto Rico抗性品系中钠离子通道含有kdr突变位点V1023I和F1565C[24]，对拟除虫菊酯杀虫剂具有高抗性。本研究中氯氟醚菊酯和四氟甲醚菊酯对Puerto Rico品系的驱避作用均减弱，而DEET对Puerto Rico品系的驱避作用则与敏感品系无显著性差异。Yang等[14]发现埃及伊蚊Puerto Rico品系对DEET、四氟苯菊酯、除虫菊素和氯氟醚菊酯的驱避作用均比敏感品系弱，且氯氟醚菊酯的驱避作用减弱程度比四氟甲醚菊酯高，差异显著。而Bowman等[25]则发现氯菊酯、溴氰菊酯和醚菊酯对Puerto Rico品系的接触驱避作用和非接触驱避作用均与敏感品系无显著性差异。

EAG试验结果表明白纹伊蚊和埃及伊蚊能识别高浓度四氟甲醚菊酯，但是不能识别氯氟醚菊酯和其他测试的拟除虫菊酯杀虫剂。四氟甲醚菊酯与氯氟醚菊酯、四氟苯菊酯属于易挥发性拟除虫菊酯杀虫剂，挥发性无显著性差异（ChemicalBook），所以造成这一现象的原因不是由于药物挥发性，很可能是由于四氟甲醚菊酯纯度低，含有少量杂质，而蚊子触角对杂质有较强的嗅觉反应（未发表），正如最近Liu等[26]研究表明天然除虫菊素中微量物质(E)-β-法尼烯（EBF）在对蚊子的驱避行为中起重要作用。Yang等[14]发现四氟苯菊酯和氯氟醚菊酯具有很强的EAG响应，四氟苯菊酯的EAG反应甚至是DEET的2倍，这与本文研究结果不一致。Yang等[14]在EAG试验中采用10 mg拟除虫菊酯，远高于行为试验中药剂使用浓度，而本文EAG试验药剂浓度与驱避行为试验一致，设计更合理，驱避行为试验与EAG试验的结果对比更能说明驱避作用不只是由嗅觉系统引起的。此外，本文也测试了白纹伊蚊和埃及伊蚊对10 mg拟除虫菊酯杀虫剂的EAG反应，与文中上述结果一致，氯氟醚菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、四氟苯菊酯均无明显EAG反应（图6）。本文与Yang等[14]研究结果不一致的原因很有可能是因为溶剂不同，Yang等[14]使用丙酮作为溶剂，蚊子对丙酮的嗅觉反应强烈，测试过程中丙酮挥发不完全会导致蚊子产生强烈的 EAG反应，而本文使用正己烷作为溶剂，正己烷引起的嗅觉反应非常小，因此试验结果较为可靠。

本研究发现10-3、10-2mol/L四氟甲醚菊酯只有微弱的EAG反应，而氯氟醚菊酯完全没有EAG反应，但是对白纹伊蚊和埃及伊蚊却有显著的驱避现象，可见拟除虫菊酯杀虫剂对白纹伊蚊和埃及伊蚊的驱避作用主要不是通过嗅觉系统产生的。拟除虫菊酯杀虫剂对Puerto Rico品系的驱避作用减弱，而DEET对Puerto Rico品系的驱避作用则与敏感品系无显著性差异，由于拟除虫菊酯杀虫剂的靶标是钠离子通道，而DEET则不是，表明很有可能钠离子通道上的kdr突变在拟除虫菊酯杀虫剂对埃及伊蚊的驱避行为中具有一定的作用，即钠离子通道可能在拟除虫菊酯杀虫剂的驱避作用中行使一定功能，但是要确证钠离子通道在拟除虫菊酯杀虫剂对蚊子的驱避行为中发挥功能还需进一步的研究。