鸢尾草和体外冲击波对去势大鼠骨折愈合的影响△

谢河秋，李 力，杨紫芳

（驻马店市中心医院a.疼痛科；b.神经外科，河南驻马店463000）

骨质疏松症是一种临床常见的代谢性骨病，随着年龄的增长而逐渐加剧，尤其是在绝经后的女性中［1］。骨质疏松会导致骨矿物质密度下降、骨质量下降以及骨骼的微结构性骨折，而骨质疏松患者的骨折修复难度极大，有效促进骨折愈合具有重要的临床意义［2］。研究发现，核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2）/OH-1通路在绝经后骨质疏松的发病过程中起重要作用，其激活可以增强对内源性抗氧化剂对活性氧（ROS）的抑制作用，从而促进骨再生［3］。体外冲击波（extracorporeal shock waves,ESW）主要被用于结石的治疗，近年来研究显示，ESW可以促进骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP），从而加速骨形成和骨愈合［4，5］。中药也在骨质疏松的治疗中起到了重要作用，鸢尾素（irisin）主要由骨骼肌合成和分泌，可促进成骨细胞的再生，增加皮质骨的质量和强度，并使破骨细胞减少，从而发挥增加骨量的作用，研究发现，其可通过调控Nrf2抑制绝经后骨质疏松大鼠成骨细胞凋亡，缓解骨质疏松［6］，然而是否会促进骨折愈合仍不清楚。本文主要分析鸢尾素联合ESW治疗去势骨质疏松性骨折模型大鼠的作用机制，为临床更好地治疗骨质疏松性骨折提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组

80只雌性SD大鼠随机分为5组，分别为假手术组、模型组、模型+ESW组、模型+鸢尾素组、模型+ESW+鸢尾素组，每组16只。

1.2 动物模型建立与处理

1:1体积的盐酸甲苯噻嗪（5 mg/kg）和盐酸唑拉西泮（20 mg/kg）麻醉大鼠，切除大鼠的两个卵巢（ovariectomy,OVX)［7］。其中，假手术组大鼠仅行开腹，没有切除卵巢。

OVX术后12周后再次麻醉大鼠，切开并暴露右侧股骨，通过击打的方法建立股骨骨折模型，然后使用1 mm克氏针固定。影像检查确认建模情况，并肌肉注射8万单位青霉素预防感染。

ESW干预通过ESW治疗仪进行［8］，能量密度为0.25 mJ/mm2，频率为5 Hz，脉冲次数为1 600次，每周1次，共治疗8周。鸢尾素的干预方法为骨折部位局部注射，浓度为500 ng/ml，剂量为0.1 ml，每周1次，连续 8 周［9］。

药物干预8周后，对大鼠采用二氧化碳安乐死，分别进行以下检测。

1.3 检测指标

1.3.1 骨密度和破骨细胞指数

采用小动物骨密度仪检测左侧股骨密度。然后，取出中段骨痂组织，将组织在4%的多聚甲醛中浸泡过夜将其固定，固定后使用石蜡进行常规包埋。然后利用切片机将样本切成5 μm厚的切片。制作成玻片标本后加入苏木精（10%，室温，10 min）和曙红（0.5%，室温，10 min）分别对细胞质和细胞核进行染色。在每个样本中随机选择三个高倍视野进行观察，破骨细胞指数即为单位面积中破骨细胞数目（个/μm2）。

1.3.2 MicroCT扫描

使用Micro-CT机在555 uA电流和42 kV电压下扫描，层厚为1 mm，分辨率为8.73 μm，扫描角度为360°，以骨折部位为中点分别在上部和下部各选择200张，然后统计骨体积分数（BV/TV）以及骨小梁的数量、厚度和分离度。

1.3.3 Western blot

将中段骨痂组织，假手术组取骨组织，裂解后收集总蛋白。通过8%的SDS-PAGE分离每个样品中等量（50 μg）的蛋白质，并将其转移到硝酸纤维素膜上。然后将5%脱脂牛奶完全浸没硝酸纤维素膜来封闭非特异性抗原（室温下2 h），将膜分别与一抗（1∶800稀释）在4°C下孵育过夜，然后将山羊抗免IgG二抗按照1∶2 000的比例稀释并在室温下孵育1 h进行反应。使用化学发光试剂显示，使用Quantum One软件分析灰度计算BMP2、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、Nrf2、OH-1蛋白相对于GAPDH的表达量。

1.3.4 RT-qPCR

使用RNeasy Mini试剂盒取中段骨痂组织（假手术组取骨组织）中的总RNA，然后使用Bestar qPCR RT试剂盒将其逆转转录为cDNA，条件如下：37°C/15 min；98°C/5 min。然后使用 Bestar™qPCR 预混液进行qPCR实验，条件如下：95°C/2 min，94°C/20 s，58 °C 20 s，72 °C/20 s，40 个循环，最后在 72 °C下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列检测系统进行RT-qPCR分析。通过比较循环阈值并以GAPDH作为内参计算Nrf2、OH-1 mRNA相对表达水平

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 骨密度和破骨细胞指数

骨密度和破骨细胞指数检测结果见表1，骨密度检测值由高至低依次为，假手术组＞模型+ESW+鸢尾素＞模型+ESW组＞模型+鸢尾素组＞模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。破骨细胞指数由低至高依次为，假手术组＜模型+ESW+鸢尾素组＜模型+鸢尾素组＜模型+ESW组 ＜模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 五组动物股骨骨折标本骨密度和破骨细胞指数检测结果（±s）与比较

表1 五组动物股骨骨折标本骨密度和破骨细胞指数检测结果（±s）与比较

注：aP＜0.05 vs.假手术组；bP＜0.05 vs.模型组；cP＜0.05 vs.模型+ESW组；dP＜0.05 vs.模型+鸢尾素组

指标P值骨密度（m g/c m 2）破骨细胞指数（n/μ m 2）假手术组（n=1 6）8 2.9 3±5.1 8 3 5.7 2±3.1 5模型组（n=1 6）4 9.4 7±4.8 5 a 7 4.1 8±7.2 9 a模型+E S W组（n=1 6）6 0.2 1±5.2 7 b 6 4.0 6±5.7 6 b模型+鸢尾素组（n=1 6）5 9.6 2±5.4 6 b 5 9.7 2±5.0 4 b模型+E S W+鸢尾素组（n=1 6）7 7.9 4±7.0 4 cd 4 2.5 8±4.2 2 cd＜0.0 0 1＜0.0 0 1

2.2 MicroCT检测

MicroCT检测结果见表2。骨表面积骨体积比值（bone surface/bone volume,BS/BV）由高至低依次为，模型+ESW+鸢尾素＞模型+鸢尾素组＞模型+ESW组＞模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。骨小梁数（trabecular number,Tb.N）由高至低依次为，模型+ESW+鸢尾素组＞模型+鸢尾素组＞模型+ESW组＞模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。骨小梁厚度（trabecular thickness,Tb.Th）由高至低依次为，模型+ESW+鸢尾素组＞模型+ESW组＞模型+鸢尾素组＞模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。骨小梁分离度（trabecular separation,Tb.Sp）由低至高依次为，模型+ESW+鸢尾素＜模型+鸢尾素组＜模型+ESW组＜模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）

表2 五组动物股骨骨折中心样本microCT检测结果（±s）与比较

表2 五组动物股骨骨折中心样本microCT检测结果（±s）与比较

注：aP＜0.05 vs.假手术组；bP＜0.05 vs.模型组；cP＜0.05 vs.模型+ESW组；dP＜0.05 vs.模型+鸢尾素组

指标假手术组（n=1 6）P值B S/B V（%）T b.N（1/m m）T b.T h（μ m）T b.S p（μ m）- - - -模型组（n=1 6）3 7.1 5±2.1 4 0.1 2±0.0 1 0.1 1±0.0 1 5.0 2±0.6 5模型+E S W组（n=1 6）4 4.3 5±3.2 5 b 0.2 0±0.0 2 b 0.2 1±0.0 2 b 4.4 7±0.4 9 b模型+鸢尾素组（n=1 6）4 7.5 2±3.8 7 b 0.2 1±0.0 2 b 0.2 0±0.0 2 b 4.3 0±.0 4 7 b模型+E S W+鸢尾素组（n=1 6）5 1.7 4±4.0 2 c、d 0.2 7±0.3 0 c、d 0.2 7±0.3 0 c、d 3.4 5±0.3 6 c、d＜0.0 0 1＜0.0 0 1＜0.0 0 1＜0.0 0 1

2.3 Western blot检测结果

Western blot检测结果见图1、表3。BMP2表达量由高至低依次为，模型+ESW+鸢尾素＞假手术组＞模型+鸢尾素组＞模型+ESW组＞模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。VEGF表达量由高至低依次为，模型+ESW+鸢尾素组＞假手术组＞模型+ESW组＞模型+鸢尾素组＞模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。Nrf2F表达量由高至低依次为，假手术组＞模型+ESW+鸢尾素＞模型+鸢尾素组＞模型+ESW组＞模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。OH-1表达量由高至低依次为，假手术组＞模型+ESW+鸢尾素组＞模型+鸢尾素组＞模型+ESW组＞模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 Westernblot凝胶电泳图 1a:BMP2和VEGF检测凝胶电泳 1b:Nrf2和OH-1蛋白检测凝胶电泳

表3 五组动物股骨骨折中心样本Wester blot检测结果（蛋白相对表达量，±s）与比较

表3 五组动物股骨骨折中心样本Wester blot检测结果（蛋白相对表达量，±s）与比较

注：aP＜0.05 vs.假手术组；bP＜0.05 vs.模型组；cP＜0.05 vs.模型+ESW组；dP＜0.05 vs.模型+鸢尾素组

指标P值B M P 2 V E G F N r f 2 O H-1假手术组（n=1 6）2.2 1±0.1 9 1.9 7±0.1 7 3.1 2±0.2 7 2.8 9±0.2 6模型组（n=1 6）0.3 4±0.0 3 a 0.5 2±0.0 5 a 0.4 9±0.0 4 a 0.4 2±0.0 4 a模型+E S W组（n=1 6）1.2 9±0.1 1 b 1.9 1±0.1 6 b 1.4 5±0.1 2 b 1.7 0±0.1 4 b模型+鸢尾素组（n=1 6）1.4 5±0.1 2 b 1.8 5±0.1 5 b 1.6 7±0.1 4 b 1.7 6±0.1 5 b模型+E S W+鸢尾素组（n=1 6）2.2 8±0.2 0 c、d 2.3 0±0.2 0 c、d 2.9 5±0.2 7 c、d 2.7 7±0.2 5 c、d＜0.0 0 1＜0.0 0 1＜0.0 0 1＜0.0 0 1

2.4 RT-qPCR检测结果

RT-qPCR检测结果见4。Nrf2 mRNA相对表达量由高至低依次为，假手术组＞模型+ESW+鸢尾素组＞模型+鸢尾素组＞模型+ESW组＞模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。OH-1 mRNA相对表达量由高至低依次为，假手术组＞模型+ESW+鸢尾素组＞模型+鸢尾素组＞模型+ESW组＞模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表4 五组动物股骨骨折中心样本RT-qPCR检测结果（mRNA相对表达量，±s）与比较

表4 五组动物股骨骨折中心样本RT-qPCR检测结果（mRNA相对表达量，±s）与比较

注：aP＜0.05 vs.假手术组；bP＜0.05 vs.模型组；cP＜0.05 vs.模型+ESW组；dP＜0.05 vs.模型+鸢尾素组

指标P值N r f 2 m R N A O H-1 m R N A假手术组（n=1 6）4.5 2±0.3 5 4.4 9±0.3 9模型组（n=1 6）0.8 5±0.0 8 a 0.8 1±0.0 8 a模型+E S W组（n=1 6）2.9 7±0.2 4 b 3.0 4±0.2 5 b模型+鸢尾素组（n=1 6）3.2 4±0.2 9 b 3.2 2±0.2 8 b模型+E S W+鸢尾素组（n=1 6）4.2 0±0.3 8 c、d 4.3 8±0.3 9 c、d＜0.0 0 1＜0.0 0 1

3 讨论

绝经妇女是骨质疏松症的高危人群，目前已经发现了许多预防绝经后骨质疏松的可能方法，例如药物治疗、中药、体育锻炼、机械刺激和电刺激［10］。而非药物方法包括锻炼计划和生物物理干预，ESW治疗、磁场和低强度脉冲超声是常见生物物理干预措施，而ESW也有助于提高骨质疏松合并骨折患者的疗效［11］。但是，其具体疗效和机制仍需要进一步研究。

ESW是一种携带能量并可以通过软组织传播的短时声波，是一种经济有效的非侵入性治疗方式，已广泛用于各种疾病的临床治疗，主要包括肾结石、勃起功能障碍和肌肉骨骼疾病［12］。最新研究显示，ESW具有促进骨折愈合的作用［13］。鸢尾素是一种肌动蛋白，由骨骼肌分泌，鸢尾素最初被认为是脂肪组织褐变的活化剂，具有缓解肥胖症和糖尿病的作用［14］。最新研究结果显示鸢尾素可诱导骨形成，增加皮质骨的质量和强度，使破骨细胞减少，从而发挥增加骨量的作用［15］。本研究通过OVX诱导大鼠骨质疏松，并构建股骨FF模型，分析ESW和鸢尾素联合使用对骨折愈合的影响。结果显示，ESW和鸢尾素单独干预均能够提高骨密度，减少破骨细胞数目，并诱导骨痂生成促进骨折部位的愈合，并且ESW和鸢尾素联合对骨密度和骨折愈合的促进作用更显著。这提示对于骨质疏松骨折大鼠，鸢尾素和ESW二者能够协同，共同作用加速骨再生和骨愈合。

为进一步分析ESW和鸢尾素联合促进骨质疏松大鼠骨折愈合的机制，本研究检测了骨痂组织中BMP2和VEGF蛋白的表达量，以及Nrf2、OH-1蛋白水平。研究显示ESW对伤口愈合、血管生成、组织再生和骨骼重塑具有积极作用［16］。而BMP2蛋白是一种分泌蛋白，是促进软骨和骨形成的关键蛋白，其水平升高提示骨再生，是骨折愈合的积极因子［17］。VEGF是促进血管生成的关键因子，有研究显示 ESW 可通过诱导 VEGF促进血管生成［18］。VEGF受到Nrf2/HO-1通路的调控，Nrf2/HO-1通路会抑制氧化应激反应，发挥抑制破骨细胞的作用，并Nrf2/HO-1通路也会通过促进VEGF的表达促进血管生成，起到组织修复的作用［19，20］。本研究结果显示，ESW和鸢尾素均可显著促进BMP2和VEGF蛋白的表达，并提高Nrf2和OH-1的转录水平和蛋白表达量，二者联合可进一步促进它们的表达水平。Yu等［21］的研究结果显示，ESW可通过上调Nrf2/OH-1通路促进VEGF的表达，从而促进血管再生缓解缺血/再灌注损伤。研究发现，鸢尾素可通过激活Nrf2通路缓解氧化型低密度脂蛋白诱导的血管生成受损［22］。Kubo等［23］的研究也显示鸢尾素具有促进Nrf2/OH-1通路的功能。提示在ESW的基础上联合鸢尾素干预可刺激Nrf2/OH-1通路上调，会促进VEGF蛋白的表达诱导血管生成，从而促进血液循环，加速骨痂形成，并提高BMP2的表达，不但提高骨密度促进了骨形成，进而促进骨折愈合。

综上所述，鸢尾素联合ESW可激活Nrf2/OH-1通路并促进VEGF和BMP2蛋白的表达，促进骨质疏松大鼠的骨折愈合。关于鸢尾素联合ESW对骨质疏松骨折患者的治疗效果值得进一步的临床实验证明，为治疗骨质疏松骨折患者提供新思路。