饥饿及不同饵料对蛤仔EPA/DHA含量的影响

吴婉婷 ，刘 括，左陆雅 ，梁 腾

（1.大连海洋大学，辽宁 大连 116023；2.大连上品堂海洋生物有限公司，辽宁 大连 116000）

菲律宾蛤仔（Ruditapes Philippines，以下简称为蛤仔）是我国四大养殖贝类之一，为世界性养殖贝类[1]，市场潜力巨大。

蛤仔为滤食性贝类，对适口性食物无选择性。影响贝类生长的主要营养物质是不饱和脂肪酸，它直接制约贝类的变态率、幼虫的生长率及无灰分干重指标，特别是甾醇的种类和含量对海洋贝类的生长发育有着直接的影响。不饱和脂肪酸对贝类的摄食效率、消化率有明显的促进作用，尤其是在促进贝类幼虫和稚贝时期生长的效果明显快于成贝[2]。

具备生物活性的不饱和脂肪酸越来越成为现阶段水产动物研究的热点，它具有多种生物功能：能够使水产养殖的动物自身免疫力得到增强，提高水产养殖动物的抗逆性，减少其死亡率，改善水产养殖动物的生长状况以及其对饲料的利用效率，促进营养物质代谢，并且可以对免疫细胞及免疫因子的信号传导、基因表达、消除自由基、促补体作用以及促进细胞膜流动、激活细胞膜上酶产生生理学作用。不饱和脂肪酸还是一种免疫增强剂，它的促进生长作用与免疫调节作用紧密联系在一起[3]。不饱和脂肪酸通过改善机体的原有防御体系，减少机体的免疫反应产物对摄食和生长的抑制，降低免疫激活水平，促进动物的生长，即不饱和脂肪酸是动物非特异性免疫反应得到提升后，以实现削弱特异免疫反应的免疫能力，从而去减少细胞免疫因子的产生来达到促进养殖贝类生长的目的。

不饱和脂肪酸中的EPA/DHA是维持机体生活的重要营养物质。蛤仔的EPA/DHA一方面是其维持自身生命活动的主要营养来源，另一方面为人类提供了丰富的营养物质，因此，通过饥饿及不同饵料对蛤仔EPA/DHA含量影响，旨在阐述蛤仔EPA/DHA的合成能力，为蛤仔的健康养殖业提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取辽宁大连庄河海区壳型完整、无损伤的蛤仔作为实验材料。实验材料运回实验室后，充气换水暂养3 d。随机测量40个蛤仔的表型性状。统计分析得到壳长、壳高、壳宽及鲜重分别为37.15±4.93 cm，24.04±2.07 cm，15.23±0.90 cm，8.58±1.78 g。

1.2 实验方法

将选取的100个健康、活力良好的蛤仔放入40 L塑料水槽内充气培养。实验设置饥饿组（1）金藻投喂组（2）盐藻投喂组（3）金藻和盐藻投喂组日投饵量为50万cells/mL。每天投饵2次，全量换水1次，换水时挑除死贝，洗净水槽。本实验共设置3个重复组。实验的周期为7 d。

1.2.1 气象色谱法测定EPA/DHA含量

采用气象色谱法测定不同实验组蛤仔的EPA/DHA。

1.2.2 蛤仔脂肪提取

解剖蛤仔，取1～5 g的软体部（脂肪含量约为100～200 mg）转移至烧瓶中，在烧瓶中加入100 mg的焦性食子酸（十一碳酸和甘油三脂内标溶液）和沸石。加入2 mL的乙醇（95%）混合均匀。加入10 mL的盐酸后混合均匀[4]。再把烧瓶转移到70～80°C的水浴。水解40 min，每10 min振荡烧瓶，在混合水解溶液完成以后，移开烧瓶，冷却至室温，加入10 mL的乙醇（95%）混合均匀[5]。

在脂肪的水解产物转移后，用50 mL乙醚冲洗烧瓶，在分液漏斗中倒入乙醚石油醚混合洗涤液，盖紧瓶塞子摇晃5 min，静放10 min，醚层提取收集250 mL加入三角瓶按照上面的步骤。再反复提取1次，在瓶中加入乙醚和石油醚混合洗涤液进行洗涤收集250 mL三角瓶中，挥发溶剂，脂肪残留提取物。

在250 mL三角瓶提取8 mL 2%的氢氧化钠溶液，把回流冷凝器连接上，连接后在80℃水浴中回流，回流到油滴消失为止。在15%顶三氟化硼甲醇溶液7 mL回流冷凝器80℃水浴2 min。回流冷凝器用去离子水冲洗。加热停止，取出瓶子后迅速冷却降至室温，精确取10～30 mL的正庚烷，振荡2 min，加入饱和NaCl溶液，分层，从上层正庚烷萃取液取出5 mL，转移到30 mL小试管中，加入3～5 g无水NaSO4震动1 min，静放5 min吸取上层溶液为样品瓶[6]。

在样品脂肪提取中应注意在第一次检测时，组分不确定的样品中不要加入内标物。在内标物C11的峰位置处观察是否出现干扰峰，如果存在干扰峰，加内标检时测的时候对内标物C11的峰进行必要校正[7]。

1.2.3 EPA/DHA含量测定

色谱测定的参考条件见表1。

表1 色谱测定的参考条件

1.2.4 色谱测定

在气相色谱仪中注入l0 μL脂肪酸甲酯标准液和各组别脂肪酸甲酯标准溶液，测定这些色谱条件下的标准溶液反应（峰值高度或面积），及各脂肪酸甲酯色谱相对保留时间，计算出响应因子。

1.3 数据统计

使用R软件作图，并进行单因素方差分析及t-test检验，差异显著性设置为P＜0.05。

2 实验结果

2.1 不同实验组的EPA含量

不同实验组的EPA含量比较结果如图1、图2所示。结果表明，饥饿组、金藻投喂组及盐藻投喂组的蛤仔EPA含量差异显著（P＜0.05）。各实验组EPA含量由多到少为饥饿组（1）＞金藻投喂组（2）＞盐藻投喂组（3）。

图1 不同实验组EPA含量比较

图2 不同实验组EPA含量方差分析

2.2 不同实验组的DHA含量比较

不同实验组的DHA含量比较结果如图3、图4所示。结果表明，各实验组DHA含量由多到少为饥饿组（1）＞金藻投喂组（2）＞盐藻投喂组（3）。饥饿组与金藻投喂组DHA含量差异不显著（P＞0.05）。饥饿组和盐藻投喂组的DHA含量差异显著（P＜0.05）。

图3 不同实验组DHA含量比较

图4 不同实验组DHA含量方差分析

3 讨论

本实验以蛤仔为材料，测定分析饥饿处理、投喂金藻、投喂盐藻，实验组的蛤仔EPA/DHA含量，结果表明，饥饿组、金藻投喂组及盐藻投喂组的蛤仔EPA含量差异显著（P＜0.05）。以往研究报道表明，投喂处在浮游幼虫阶段的贝类，金藻投喂的效果比硅藻投喂的效果更好。金藻对稚贝的变态发育有明显作用。原因可能是由于处于不同生长阶段的贝类所需要的营养有所不同，所以不同生长阶段的贝类对饵料的需要就会存在不同。王庆志等[8]选取了健康的大连魁蚶稚贝，在温度23.5～24.0℃和盐度29.5～30.0环境条件下，用小球藻，牟氏角毛藻，等边金藻，新月菱形藻这4种单细胞藻类单独投喂和组合投喂魁蚶的稚贝，并观察24 h以后单独投喂和组合投喂两种方式对魁蚶稚贝存活生长的影响。结果表明，单独投喂时，等边金藻组喂养的稚贝生长最快，小球藻组投喂的稚贝生长最慢。然而组合投喂组（其他3种单细胞藻与等边金藻混合（1∶1））中，稚贝的壳长和特定生长率都高于其他组的稚贝[3]。其中与小球藻组合投喂的效果最好。李文波等[9]在2012年进行了不同的饵料对西施舌稚贝的生长和消化酶的活性影响的研究，得出结果饵料是幼虫变态的物质基础，是幼虫培养成败的关键。随着西雅舌人工育苗的规模化生产，单细胞藻饵料的日常供应成为一种挑战。在2011年，马斌等[10]通过比较8种常见的饵料微藻单独和组合投喂对缢蛏稚贝的生长影响，筛选出了适合缢蛏稚贝的饵料最优的组合，结果表明，单独投喂时金藻跟角毛藻最佳，在混合投喂时，存在一些单独投喂效果不理想的微藻品种，这些微藻品种就可以在优质饵料不足的时候作为补充。

饥饿组与金藻投喂组DHA含量差异不显著（P＞0.05）；饥饿组和喂养有显著性差异的DHA含量（P＜0.05）；投喂金藻组与盐藻组 DHA含量差异显著（P＜0.05）。研究表明，金藻中sfa，mufa，pufa含量都高于杜氏盐藻[11]。在本实验中金藻组蛤仔的EPA/DHA含量高于盐藻组蛤仔EPA/DHA含量。说明蛤仔可以在体内自身合成EPA和DHA[12]。

本研究表明短时间饥饿可以提高蛤仔体内的DHA含量，不同饵料对蛤仔EPA和DHA的合成有显著影响。在自然界中，海洋微藻是能合成EPA和DHA的少数生物之一。它们具有巨大的开发利用潜力。微藻脂肪酸的组成与其种类和品种有关系，同时也受环境因素影响。温度、营养素、生长周期、光照等等都可以导致EPA和DHA的含量变化，从而影响了微藻脂肪酸的组成。

4 结论

（1）本实验以蛤仔为材料，通过饥饿处理、投喂金藻、盐藻，测定不同实验组的蛤仔EPA含量。结果表明，饥饿组、投喂金藻组及投喂盐藻组的蛤仔EPA含量差异显著（P＜0.05）。

（2）饥饿组与金藻喂养组DHA含量差异不显著（P＞0.05）；饥饿组和投喂杜氏盐藻含量有显著性差异（P＜0.05）；金藻投喂组与盐藻投喂组 DHA含量差异显著（P＜0.05）。研究表明，金藻中EPA和DHA含量都高于盐藻。说明蛤仔可以在体内自身合成EPA和DHA。

（3）本研究表明短时间饥饿可以提高蛤仔体内的DHA含量，不同饵料对蛤仔EPA和DHA的合成有显著影响。金藻中含有的EPA/DHA前体较多，蛤仔可能具有合成EPA/DHA含量的效果。在自然界中，海洋微藻是能合成EPA和DHA的少数生物之一。