水果中葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇的测定*

匡立学，聂继云，徐国锋，李 静，张建一，高贯威，程 杨

（中国农业科学院果树研究所，农业农村部果品质量安全风险评估实验室（兴城），农业农村部果品及苗木质量监督检验测试中心（兴城），辽宁兴城125100）（2 青岛农业大学）

我国是水果生产大国，面积、产量均居世界第一[1-5]。根据国家统计局数据，2019 年全国水果产量为2.568 8 亿t[6]。水果中含有各类的糖类、有机酸、芳香物质、维生素以及矿物质等营养成分，其中糖类占比对了解水果的风味特征、综合评价水果产品质量都有重要意义[7-10]。葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇是水果的主要糖组分，其含量与组成是水果营养和风味的重要评价指标[11-14]。4 种糖均为可溶性糖，其中，蔗糖为非还原糖，其余3 种为还原糖。4 种糖的甜度差异很大，分别为1.75、1、0.75 和0.4[15-18]。只有获得水果中4 种糖组分的准确含量数据，才能进行水果营养和甜酸风味的准确评价。高效、准确、稳定的糖组分含量检测方法将为水果糖组分测定和水果风味评价提供重要的技术支撑。虽然我国制定有《食品安全国家标准 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》（GB 5009.8—2016），但其测定参数不包括山梨醇[19]。同时，水果是有生命的活体，含有蔗糖转化酶，采用该方法检测时，样品提取和样液制备过程中蔗糖会水解转化为葡萄糖和果糖，导致测定结果严重失真，无法准确进行水果营养和风味评价。

鉴于此，笔者对水果中葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇含量的测定开展了研究，根据不同种类的水果中各种糖组分含量的不同，选择苹果、梨、桃、李、蓝莓、葡萄、橙、香蕉、火龙果和龙眼10 种代表性水果为试材，所选试样涵盖仁果类、核果类、浆果类、柑橘类和热带水果。并对前处理方法包括样品制备方式、提取方式以及提取时间等方面进行了优化，以确保检测结果准确可靠。该研究旨在为水果中葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇含量测定方法标准的制定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ICS-5000 多功能离子色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）；分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；冷冻研磨仪（德国莱驰公司）；超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；离心机（天美仪拓实验室设备（上海）有限公司）。葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇（纯度为99%，美国Sigma 公司）；甲醇、50%氢氧化钠溶液（色谱纯，默克公司）。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液的配制：分别称取葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇各50 mg 于4 个50 mL 容量瓶中，用水溶解并定容，配制成1.0 mg/mL 的标准储备液。

标准工作溶液的配制：分别量取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 葡萄糖、果糖、蔗糖标准储备液和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 山梨醇标准储备液于6 个100 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，配制成4 种糖组分的混合标准溶液，混合标准溶液中葡萄糖、果糖、蔗糖的浓度分别为5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L，山梨醇的浓度分别为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/L。

1.3 试样的测定

称取5.0 g 处理后的试样于离心管中，加入提取剂，提取后的试样用9 000 r/min 的离心机离心15 min，将上清液转移至50 mL 容量瓶中，定容，得到样品提取液。吸取1.0 mL 样品提取液于50 mL 容量瓶中，用水定容至刻度进行稀释。依次用5 mL甲醇和5 mL 水预淋洗、活化固相萃取小柱。吸取5.0 mL 稀释后的样品提取液加入活化好的固相萃取小柱，弃去2 mL 初始滤液，收集滤液供离子色谱分析测定。

1.4 色谱条件

色谱柱：阴离子交换柱（PA10），250 mm×4.0 mm；柱温：30 ℃；流动相：流动相A 为水，流动相B 为200 mmol/L 氢氧化钠溶液；流速：1 mL/min；洗脱程序按表1 设置。

表1 洗脱程序

1.5 试验设计

单因素试验：以葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇含量为指标，分别考察试样制备方式（匀浆和冷冻研磨）、提取溶剂（水提和醇提）、提取方式（水浴和超声）对苹果样品中4 种糖组分含量的影响。

多因素试验：在单因素试验的基础上，对不同影响因素进行组合试验，比较样品不同前处理方式对检测结果的影响。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的优化

样品的前处理主要包括样品的制备和提取，根据参考文献，果品中的营养功能组分的测定常采用匀浆和冷冻研磨2 种试样制备方式，提取溶剂常为水提和醇提，提取方式常采用水浴和超声2 种[20-22]。因80 ℃水浴提取会造成甲醇挥发，所以醇提只采用超声方式。为了进一步优化试验方案，我们首先以苹果为试材对不同提取方式下的提取时间对糖组分提取效果的影响进行了研究。

2.1.1 水浴不同提取时间对糖组分提取效果的影响

取24 个50 mL 塑料离心管，每个离心管称取5 g 冷冻研磨的苹果样品，加水定容至50 mL，分别置于80 ℃和20 ℃水浴下提取，提取时间分别为10、20、30、40 min，提取后进行离心、稀释、过滤后上机测定。

比较不同提取时间对水果中糖组分含量的影响，并进行差异显著性分析，结果发现水浴的不同提取时间对山梨醇含量的提取测定并无显著差异；80 ℃水浴提取的葡萄糖含量显著高于20 ℃提取的，80 ℃水浴下不同提取时间的葡萄糖含量并无显著差异；80 ℃水浴10 min 和水浴20 min 的果糖含量略高于其他处理，显著高于20 ℃水浴10 min提取含量，80 ℃水浴10 min 和水浴20 min 的果糖含量无显著差异，但20 min 提取时平行样之间的标准差较小，重复性好；80 ℃水浴20 min 蔗糖含量最高，提取效果最好。因此确定20 min 为其最佳水浴时间（表2）。

表2 水浴不同提取时间对苹果样品中糖组分含量的影响

2.1.2 超声不同提取时间对糖组分提取效果的影响

取24 个50 mL 塑料离心管，每个离心管称取5 g 冷冻研磨的苹果样品，12 个加水定容至50 mL，其余12 个加甲醇定容至50 mL，40 kHz 的频率下室温超声提取，超声时间分别10、20、30、40 min，提取后进行离心、稀释、过滤后上机测定。

试验结果进行差异显著性分析，发现无论水提还是醇提，不同超声时间下果糖、蔗糖和山梨醇含量并无显著差异，超声20、30、40 min 下葡萄糖含量无显著差异（表3）。因此确定20 min 为其最佳超声时间。

表3 不同超声时间对苹果样品中糖组分含量的影响

2.1.3 不同前处理方式对糖组分提取效果的影响

通过前期的研究结果，我们确定了水浴和超声的最佳提取时间均为20 min。在此基础上，选用苹果、李和蓝莓为试材，进一步比较了冷冻研磨和匀浆不同样品制备方法、水提和甲醇2 种提取溶剂，以及20 min 超声和80 ℃20 min 水浴的不同组合对果品中糖组分含量的影响，并进行差异显著性分析（表4）。因80 ℃水浴提取会造成甲醇挥发，所以醇提只采用超声方式。

表4 不同前处理方式对糖组分含量的影响

由表4 可知，苹果和李中4 种糖组分均有检出，蓝莓中未检出山梨醇。对于同一种试材，不同提取方式下山梨醇含量无显著差异，表明山梨醇很稳定。对于苹果样品，研磨醇提超声处理的葡萄糖和果糖含量显著低于匀浆水提水浴处理的葡萄糖和果糖含量，研磨醇提超声处理的蔗糖含量显著高于匀浆水提水浴处理的蔗糖含量，其他处理间无显著差异。对于李样品，在样品制备方式和提取方式一致的情况下，甲醇提取的葡萄糖和果糖含量显著低于水提处理的葡萄糖和果糖含量，蔗糖含量显著高于水提处理的蔗糖含量。对于蓝莓样品，不同处理间葡萄糖和果糖含量均无显著差异，研磨醇提超声处理的蔗糖含量为3.9 g/kg，其他处理方式均未检出蔗糖。分析原因，可能是由于新鲜果实中存在蔗糖酶，在匀浆或前处理提取过程中酶发挥作用，造成蔗糖分解成葡萄糖和果糖，甲醇会使酶固化，活性降低或消失，所以，研磨醇提超声处理方式蔗糖含量高于其他处理。不同的水果中蔗糖酶的含量和作用效果均不相同，对于苹果样品，匀浆和用水提取过程中蔗糖均会有少量分解，但差异不显著。对于李样品，匀浆过程中影响不明显，用水提取过程中蔗糖含量减少明显。对于蓝莓样品，因为蓝莓样品本身蔗糖含量较低，匀浆和用水提取过程中蔗糖均会完全分解，并且分解后葡萄糖和果糖含量增加得并不显著。在样品处理方式和提取溶剂一致的情况下，水浴和超声2 种不同提取方式对水果中4 种糖组分含量无影响。综合以上研究结果，试验中最终确定研磨醇提超声处理方式作为样品前处理方式。

2.2 方法的线性

对4 种糖组分的标准溶液进行测定，由低浓度到高浓度进样。每一浓度标准溶液重复进样3 针，分别做4 种糖组分的标准曲线，计算出回归方程和相关系数。试验表明这4 种糖组分在2～50 mg/L 范围内具有良好的线性关系，相关系数在0.999 2 以上（图1～图4）。

图1 葡萄糖线性关系

图2 果糖线性关系

图3 蔗糖线性关系

图4 山梨醇线性关系

2.3 方法的准确度与精密度

选择苹果、桃、葡萄、橙、龙眼5 种有代表性水果为试材，分别对4 种糖组分进行2、10、50 g/kg 3 种水平的添加回收率试验，每个处理3 个平行进行准确度评价。结果表明，4 种糖组分在水果中添加回收率范围在81.2%～113.1%（表5）。对苹果、桃、葡萄、橙、龙眼每个样品进行5 次平行试验，计算相对标准偏差进行精密度试验，结果表明，相对标准偏差为1.8%～3.5%。可见该方法的准确度和精密度良好，能满足实际检测需要。

表5 葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇添加回收率

2.4 实际样品的测定

采用本方法对市售的苹果、梨、桃、李、蓝莓、葡萄、橙、香蕉、火龙果和龙眼10 种水果进行前处理后上机测定，葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇的保留时间分别为6.600、7.584、10.450、2.117 min（图5）。4 种糖组分含量具体见表6。

图5 水果中4 种糖组分色谱图

表6 水果样品中4 种糖组分含量

3 讨论与结论

本研究采用离子色谱法对水果中葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇含量进行了分析测定，并对样品的制备方式、提取方式、提取溶剂和提取时间进行了优化，结果表明，研磨醇提超声处理方式作为样品最佳的前处理方式。原因可能是因为样品经过冷冻研磨后提取得更充分，冷冻加醇提取的过程中使与糖分解有关的酶失活，抑制了糖组分的分解。此外，本研究还进行了方法学验证，方法的线性、精密度、准确度等指标的考察结果表明，4 种糖组分在2～50 mg/L 的范围内具有良好的线性关系，相关系数在0.999 2 以上。4 种糖组分在水果中添加回收率范围81.2%～113.1%，相对标准偏差1.8%～3.5%。反映本标准方法具有良好的准确性，能满足实际检测需要。该方法准确度高、重现性好，适用于各种水果中葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇含量的测定。