季节变化与植被类型对河南沿黄湿地微生物群落的影响

巩 涛，孙召华，张志龙，魏传军，王有科，雷 高，安明理

（1.河南省科学院生物研究所有限责任公司，郑州 450008；2.河南省地震局，郑州 450016）

越来越多的研究表明，气候变化和植被类型在土壤微生物群落结构中起着重要作用，这是由于土壤pH、温湿度以及有机质的质量和数量等季节性环境因素，可能通过根系分泌物和凋落物间接地受到地上植物的影响，从而进一步对微生物类群造成影响［1-4］.

土壤微生物通过促进湿地生态系统的物质循环和能量流动，在调节湿地生态系统平衡中发挥着重要作用，土壤微生物作为湿地生态系统的重要指示特征，多年来一直受到人们的关注［5］.以往的研究主要集中在人工湿地在污水处理中的微生物群落变化，很少有研究同时考虑季节变化和植被类型对湿地土壤微生物进化的影响，特别是在黄河流域湿地［6-8］.黄河湿地作为水陆过渡带，受水体气候和陆地环境的影响明显，它可能具有既不同于陆地环境又不同于水体环境的独特的微生物资源，这种特殊的气候类型可能导致物种的多样性和基因资源的稀缺性［9-11］.

芦苇（Phragmites communis）和野大豆（Glycine soja）是黄河湿地两种典型的植被类型.然而，它们对微生物群落组成的影响却鲜有研究.不同植被类型是否表现出独特的土壤微生物群落，是否具有相似的季节变化类型，也是一个值得研究的问题.对这些问题进入深入研究有助于促进自然保护区的管理和保护，对指导人工湿地的设计具有重要意义.本研究中，我们采用高通量测序的方法研究了不同季节及植被条件下黄河湿地土壤微生物群落结构的变化.

1 材料和方法

1.1 样品采集

采样区位于河南郑州黄河国家湿地公园.第一个采样点位于东经113°38′55″E、34°54′42″N，覆盖植被为芦苇；第二个采样点位于113°39′3″E、北纬34°54′51″N，覆盖植被为野生大豆.2017年3月、6月、9月、12月进行了取样，采集地表以下5～15 cm深度的10个土壤样品，从每个地点采集0.5 kg土壤，并将10个样品混合为1个完整的代表性样品.最后，从河南郑州黄河国家湿地公园采集了8种不同季节、不同植被类型的湿地土壤样品.

1.2 土壤理化性质测定

土壤湿度采用称重法计算，用重铬酸钾法测定总有机碳（TOC）［12］，采用凯氏定氮法测定全氮（TN）含量［13］.

1.3 DNA提取、PCR扩增和高通量测序

选择四季和两种植被类型（春1，春2，夏1，夏2，秋1，秋2，冬1和冬2，1覆盖植被为芦苇，2覆盖植被为野大豆）进行高通量测序分析.利用E.Z.N.A.TM土壤DNA试剂盒（Omega Bio-Tek，美国）提取土壤总基因组DNA，使用NanoDrop 2000超显微分光光度计（Thermo Scientific，Wilmington，USA）测定DNA浓度，选择引物515f/806r，从总基因组DNA中扩增16S rDNA的V4高变区［14］.然后利用Illumina-Miseq平台进行高通量测序.序列已存入GenBank数据库，登录号为PRJNA480720.

1.4 生物信息学与统计分析

从Illumina Miseq平台获得的序列根据利用（QIIME）软件进行分析［15］，用DPS 7.05分析不同样本间的显著差异，利用SPSS 19.0进行相关性分析.

2 结果与分析

2.1 微生物群落结构分析

共检测到26个门72个纲13个目244个科354个属的微生物类群.在所有的土壤样品中，变形菌门（Proteobacteria）是最丰富的微生物类群，平均相对丰度为30.84%；其次是酸杆菌门（Acidobacteria），平均相对丰度为22.51%.其他优势类群有拟杆菌门（Bacteroidetes）10.20%、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）8.59%、放线菌门（Actinobacteria）7.24%、绿弯菌门（Chloroflexi）6.61%、厚壁菌门（Firmicutes）3.89%、疣微菌门（Verrucomicrobia）3.65%、浮霉菌门（Planctomycetes）2.88%和硝化螺旋菌门（Nitrospirae）1.37%（图1）.

图1 门水平上不同土壤样品的细菌类别Fig.1 Bacterial categories of different soil samples at phylum level

2.2 土壤理化性质对土壤微生物群落组成的影响

各个样品土壤理化性质的季节变化见表1.土壤理化性质与样品16s rDNA基因丰度和OTU类型相关性分析（表2）显示，植被对土壤微生物的影响可能受土壤理化性质的影响.土壤微生物丰度和多样性与TOC、TN呈显著正相关（P＜0.05），土壤pH值与微生物16s rDNA基因丰度和OTU类型呈负相关，这一结果与前人的研究结果一致.例如，Waldrop［16］研究指出，微生物生物量和活性与土壤有机质和养分含量显著正相关；吴泽燕等［17］研究发现，不同植被类型下土壤微生物PLFAs含量与土壤水分、温度和有机质有关.造成这一现象的原因可能是由于植物通过落叶和根系分泌物提供了维持土壤微生物生长的大部分营养物质.逐渐地，各种土壤理化性质，如pH值、营养物质和土壤结构都能形成自己的特性，从而间接影响土壤微生物群落［18］.

表1 不同样品的土壤理化性质Tab.1 Soil physicochemical properties in different samples

2.3 微生物群落结构随季节变化

优势微生物季节动态分析（图2）显示，微生物群落在季节变化期间明显发生结构性变化.在门的分类水平上，春季样品中，酸杆菌（Acidobacteria）比率高于其他群落；夏季样品中，拟杆菌（Bacteroidetes）和放线菌（Actinobacteria）比率较高；秋季样品中，绿弯菌（Chloroflexi）和厚壁菌（Firmicutes）含量丰富；浮霉菌（Planctomycetes）、变形杆菌（Proteobacteria）和芽单胞菌（Gemmatimonadetes）的丰度在冬季到来时达到最高值.微生物群落结构的变化可能反映出它们对温度的偏好和耐受性，因为许多细菌可以产生休眠结构或抗性孢子.结果表明，浮霉菌、变形杆菌和芽单胞菌对低温的适应能力较强，类杆菌和放线菌更容易在高温下繁殖，而酸杆菌和疣微菌更适宜春季和秋季温和的环境.

图2 优势微生物群落（top10）季节变化动态Fig.2 Seasonal dynamics of dominant microbial communities（top10）at phylum level

2.4 微生物群落多样性和丰度随季节变化

Shannon-Wiener指数（图3）和16s rDNA基因拷贝数（图4）也显示了黄河湿地土壤细菌群落多样性和丰度在季节变化中的明显动态变化.先前的研究表明，微生物丰度从冬季开始增加，在夏季达到最大值［19-20］.与这些发现略有不同的是，在本研究中，从冬季到次年秋季，细菌丰度持续增加，黄河湿地群落多样性在冬季减少，秋季最高.以下几个潜在的原因可以引起这些现象：首先，秋季相对舒适、稳定的环境可能有利于微生物的生长繁殖，从而达到提高群落多样性；第二，秋季丰富的基质有利于微生物的增殖，提高微生物群落的丰富度和多样性；第三，在秋季向冬季变化过程中，由于土壤水分和养分的限制，微生物可能被直接或间接杀死.结果，虽然总体微生物丰度和多样性降低了，但抗逆性强的物种却存活下来并增加了其优势.

图3 不同季节中微生物群落的Shannon-Wiener指数Fig.3 Shannon-Wiener indexes of soil microbial communities in different seasons

图4 两种植被类型下微生物群落丰度Fig.4 Abundances of microbial communities under two vegetation types

2.5 植被类型对土壤微生物群落组成的影响

比较了黄河国家湿地公园两种典型植被类型的微生物群落组成，结果显示，植被类型对微生物群落的影响主要表现为种属差异.在每个季节样本中，前10的优势属至少存在三个差异，表明植被类型对土壤微生物群落组成有重要影响（图5）.这一结果除了物理和化学性质不同引起的差异外，还可能归因于特定地上植被的凋落物和根系分泌物的差异［21-22］.腐烂的凋落物为土壤微生物提供了栖息地、养分和能量，地上植被类型也可以通过根系释放的物质直接影响根际微生物，因为根系分泌物的特定代谢物对土壤微生物群也具有重要的生态影响［23-25］.

图5 两种植被类型中优势菌群分布情况Fig.5 Distributions of dominant genera in all samples of the two vegetation types from four seasons

3 结论

利用高通量测序技术研究了季节变化和植被类型对河南沿黄湿地土壤微生物群落的影响.研究结果证实了黄河国家湿地公园土壤微生物群落随季节变化的假设，不同植被类型湿地土壤可能表现出不同的土壤微生物群落组成.结果表明，沿黄湿地生态系统中微生物群落的多样性为秋季＞夏季＞春季＞冬季.此外，季节变化对微生物的影响不是独立的，它们还与土壤理化性质和地上植被类型的季节性生长密切相关.

由于下一代测序仪的序列长度不足以从物种水平上鉴定微生物，高通量测序方法尽管有其优点，但也存在局限性.还有一些序列被归属为未分类物种，以后结合元基因组学或更先进的技术，研究结果可以更加精细和详细.

本研究主要针对湿地生态系统中一年两种植被类型进行了研究，因此建议后续研究在多个植被类型中连续采集三年以上的样本，以最好地评估其对湿地生态系统微生物动态的影响.