原发性肝癌中LncRNA OSER1-AS1与miR-612表达的相关性及生物学意义

甘景卓

原发性肝癌包括来源于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，其中来源于肝细胞的原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)最为常见、占所有原发性肝癌的比例约85%～90%[1-2]。HCC的发病与乙型肝炎病毒感染、食用黄曲霉素感染的食物、癌基因突变或遗传表达有关[3-4]，近些年，手术切除、射频消融、经导管化疗栓塞、放化疗、分子靶向药物等HCC综合治疗手段不断进步，但HCC的整体预后仍较差、5年生存率仅5%～30%。HCC发病机制不明确是限制疾病早期诊断、靶向治疗的重要因素，因此研究HCC的发病机制是国内外关注的热点。长链非编码RNA(long noncoding RNA，LncRNA)在HCC发病中的作用受到越来越多关注，有研究报道长链非编码RNA氧化应激反应丝氨酸丰富1反义RNA 1(LncRNA OSER1-AS1)在HCC、肺癌中表达增加，提示该lncRNA可能具有促癌作用[5-6]；同时，肺癌相关的研究还证实LncRNA OSER1-AS1的促癌作用与靶向结合miR-612、增加下游原癌基因叉头框转录因子M1(forkhead transcription factor M1，FOXM1)表达有关[6]。基于此，本研究将通过临床样本检测及体外细胞实验探究原发性HCC中LncRNA OSER1-AS1与miR-612表达的相关性及生物学意义，旨在为阐明LncRNA OSER1-AS1在HCC发病中的作用及机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床样本

收集2017年3月～2020年3月我院手术切除并保存的HCC组织及对应的癌旁组织作为本研究的临床样本，均经病理学诊断为HCC且术前未接受过放化疗、介入治疗、靶向治疗。HCC组织62例、对应的癌旁组织62例，患者年龄42～67岁，平均(52.58±9.29)岁，男性38例、女性24例。本研究取得医院伦理委员会批准。

1.2 细胞株

肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2、BEL-7402及正常肝细胞株HL-7702(ATCC公司，美国)。

1.3 试剂

阴性对照(NC)siRNA(序列：5′-CTGGATTCGTGTAGCTA-3′)、LncRNA OSER1-AS1 siRNA(序列：5′-TAGCTGTAT-GCTTAGCTAGT-3′)、NC miR(序列：5′-TAGCGTAGGTA-GCTACC-3′)、miR-612模拟物(序列：5′-TATGCTATTGCT-AGCTA-3′)、miR-612抑制物(序列：5′-CTTATCGGTAGC-ATATC-3′)(上海吉玛公司，中国)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天公司，中国)；MTS法细胞存活检测试剂盒、FOXM1、β-actin一抗(Abcam公司，美国)；LncRNA OSER1-AS1的双荧光素酶报告基因以psiCHECK2载体质粒(Promega公司，丹麦)为基础进行构建(上海生工公司，中国)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司，丹麦)。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养、分组及转染

SMMC-7721、HepG2、BEL-7402及HL-7702细胞均在含有10%胎牛血清的培养基中培养，每2天更换1次培养基，待细胞铺满培养瓶底面80%～90%时用0.25%胰蛋白酶进行消化传代，传代后的细胞用于LncRNA OSER1-AS1、miR-612表达水平的检测。

为验证LncRNA OSER1-AS1的生物学功能，HepG2细胞传代后接种在不同规格培养板内，分为si-NC组和si-OSER1-AS1组，分别转染NC siRNA和LncRNA OSER1-AS1 siRNA。为验证miR-612在LncRNA OSER1-AS1发挥生物学功能中的作用，HepG2细胞传代后接种在不同规格培养板内，分为si-NC+miR-NC组、si-OSER1-AS1+miR-NC组、si-OSER1-AS1+miR-612组，分别共转染NC siRNA与NC miR、LncRNA OSER1-AS1 siRNA与NC miR、LncRNA OSER1-AS1 siRNA与miR-612 抑制物。

1.4.2 组织及细胞中LncRNA OSER1-AS1、miR-612表达水平的检测

取手术切除的HCC组织及癌旁组织，离体培养的SMMC-7721、HepG2、BEL-7402及HL-7702细胞，采用RNA提取试剂盒分离组织或细胞中的RNA，采用cDNA第一链合成试剂盒将RNA反转录为cDNA，采用lncRNA荧光定量检测试剂盒及LncRNA OSER1-AS1的特异性引物进行荧光定量PCR反应、采用miR荧光定量检测试剂盒及miR-612的特异性引物进行荧光定量PCR反应，同时对内参U6进行荧光定量PCR反应，PCR的反应程序如下：95 ℃ 15 min后94 ℃ 20 s、60 ℃ 34 s、重复40个循环。反应结束后生成循环曲线并得到循环阈值，以U6为内参，计算LncRNA OSER1-AS1、miR-612的表达水平。

1.4.3 细胞存活率检测

用于分组的HepG2细胞接种在96孔培养板内，分组转染24 h后按照试剂盒进行MTS法实验，空白的培养孔及进行转染操作的培养孔内均按照200 μL/孔加入检测液，孵育4h后在酶标仪上检测490 nm波长的光密度，计算细胞存活率(%)=(实验组光密度-空白组光密度)/(对照组光密度-空白组光密度)×100%。

1.4.4 细胞凋亡率检测

用于分组的HepG2细胞接种在48孔培养板内，分组转染24 h后按照试剂盒进行TUNEL法实验，分别进行TUNEL染色和DAPI染色，在显微镜高倍视野下观察TUNEL阳性染色细胞及DAPI阳性染色细胞并计数，计算细胞凋亡率(%)=TUNEL阳性染色细胞数/DAPI阳性染色细胞数×100%。

1.4.5 在线生物信息学分析

在Starbase网站中进行在线生物信息学分析，输入LncRNA OSER1-AS1的信息，得到该lncRNA中与miR-612互补配对的碱基序列。

1.4.6 双荧光素酶报告基因实验

将HepG2细胞接种在24孔培养板内，将野生型LncRNA OSER1-AS1报告基因与NC miR或miR-612模拟物共同转染进入细胞，24 h后收集细胞并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行荧光活力检测，根据检测结果计算萤火虫荧光值/海肾荧光值，该比值即为报告基因的荧光活力。

1.4.7 统计学方法

2 结果

2.1 HCC组织和癌旁组织中LncRNA OSER1-AS1、miR-612表达水平的比较及相关性

HCC组织中LncRNA OSER1-AS1的表达水平高于癌旁组织、miR-612的表达水平低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)；HCC组织中LncRNA OSER1-AS1的表达水平与miR-612的表达水平具有负相关关系，相关系数r=-0.397(图1)。

表1 HCC组织和癌旁组织中LncRNA OSER1-AS1、miR-612表达水平的比较

图1 HCC组织中LncRNA OSER1-AS1、miR-612表达水平的相关性

2.2 不同HCC细胞株及正常肝细胞株中LncRNA OSER1-AS1、miR-612表达水平的比较

HCC细胞株SMMC-7721、HepG2、BEL-7402中LncRNA OSER1-AS1的表达水平均高于正常肝细胞株HL-7702，miR-612的表达水平均低于正常肝细胞株HL-7702，差异有统计学意义(P<0.05),见表2；在不同HCC细胞株中，HepG2中LncRNA OSER1-AS1的表达水平最高、miR-612的表达水平最低。

表2 不同HCC细胞株及正常肝细胞株中LncRNA OSER1-AS1、miR-612表达水平的比较

2.3 敲低LncRNA OSER1-AS1对HepG2细胞存活率及凋亡率的影响

与si-NC组比较，si-OSER1-AS1组HepG2细胞的存活率降低、凋亡率增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 si-NC组与si-OSER1-AS1组HepG2细胞存活率及凋亡率的比较 A：两组细胞存活率的比较；B：两组细胞凋亡的TUNEL染色；C：两组细胞凋亡率的比较。与si-NC组比较，*P<0.05

2.4 敲低LncRNA OSER1-AS1对HepG2细胞中miR-612及FOXM1表达的影响

与si-NC组比较，si-OSER1-AS1组HepG2细胞中miR-612的表达水平增加、FOXM1的表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 LncRNA OSER1-AS1与miR-612靶向结合的验证

在线生物信息学分析显示：LncRNA OSER1-AS1序列中含有与miR-612互补配对的碱基序列(图4A)；双荧光素酶报告基因显示：miR-612组HepG2细胞中LncRNA OSER1-AS1双荧光素酶报告基因的荧光活力降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

图4 LncRNA OSER1-AS1与miR-612的靶向结合 A：生物信息学分析LncRNA SER1-AS1与miR-612的靶向结合；B：双荧光素酶报告基因验证LncRNA OSER1-AS1与miR-612的靶向结合。与miR-NC比较，*P<0.05

2.6 抑制miR-612对敲低LncRNA OSER1-AS1降低存活率、增加凋亡率的影响

与si-NC+miR-NC组比较，si-OSER1-AS1+miR-NC组HepG2细胞的miR-612表达水平及凋亡率增加，存活率降低；与si-OSER1-AS1+miR-NC组比较，si-OSER1-AS1+miR-612组HepG2细胞的miR-612表达水平及凋亡率降低，存活率增加。

3 讨论

LncRNAs是一类长度>200 nt的非编码RNA，在体内分布广泛、生物学作用复杂，在HCC的发病过程中存在多种LncRNAs表达异常[7-11]，其中LncRNA OSER1-AS1是新发现的一种促癌LncRNA，在HCC、肺癌病灶内表达增加[5-6]，但关于LncRNA OSER1-AS1生物学意义的研究并不多。本文以该LncRNA为切入点，研究了LncRNA OSER1-AS1在HCC发病中的作用。

图3 si-NC组与si-OSER1-AS1组HepG2细胞中miR-612、FOXM1表达水平的比较 A：两组细胞中miR-612表达水平的比较；B：两组细胞中miR-612表达水平的比较。与si-NC组比较，*P<0.05

本研究通过比较HCC组织与癌旁组织中LncRNA OSER1-AS1的差异表达证实：HCC组织中该LncRNA的表达水平明显增加，与既往其他学者的研究结果[5]一致。进一步比较HCC细胞株与正常肝细胞株中LncRNA OSER1-AS1的差异表达可知：三组HCC细胞株中该lncRNA的表达水平明显增加且HepG2中LncRNA OSER1-AS1表达上调最为显著。目前，LncRNA OSER1-AS1生物学功能的研究不断深入，一些研究证实在肺癌及结直肠癌中该lncRNA可促进癌细胞增殖、抑制癌细胞凋亡[6,12-13]。本研究在HepG2细胞中通过转染siRNA的方式敲低LncRNA OSER1-AS1的表达，在敲低该LncRNA后HepG2细胞的存活率降低、凋亡率增加，表明HepG2细胞中高表达的LncRNA OSER1-AS1具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用。

LncRNAs发挥生物学作用的方式是通过类似“分子海绵”的效应吸附miR，削弱miR对下游靶基因的调控作用。在肝癌的发病过程中，存在miR-612、miR-214、miR-363、miR-122等多种miRs表达的变化[14-16]。Shi等[6]在肺癌中证实LncRNA OSER1-AS1靶向抑制miR-612、削弱miR-612对下游原癌基因FOXM1的抑制作用，进而增加FOXM1的表达。本研究在HCC组织中检测到miR-612的表达水平降低且与LncRNA OSER1-AS1呈负相关，提示LncRNA OSER1-AS1可能在HCC的发病过程中靶向调控miR-612。在离体培养的HepG2细胞中，敲低LncRNA OSER1-AS1后miR-612的表达增加、其下游FOXM1的表达增加，并且miR-612模拟物使LncRNA OSER1-AS1报告基因的荧光活力降低，提示在HCC细胞中LncRNA OSER1-AS1与miR-612存在靶向结合的作用，高表达的LncRNA OSER1-AS1可能通过靶向抑制miR-612表达、增加FOXM1表达的方式参与增殖及凋亡的调控。

miR-612是已知在HCC发病过程中起抑癌作用的一种miR[17-20]，FOXM1是受到miR-612调控的靶基因之一，也是参与多种恶性肿瘤发病的原癌基因之一[21-22]。在HCC发病过程中，FOXM1表达增加[23]且介导促进癌细胞增殖、抑制癌细胞凋亡的生物学效应[24-25]。本研究已经证实敲低LncRNA OSER1-AS1使miR-612表达增加、FOXM1表达降低，miR-612、FOXM1表达变化预期的生物学效应与敲低LncRNA OSER1-AS1抑制增殖、促进凋亡的效应吻合。进一步在敲低LncRNA OSER1-AS1的同时转染miR-612抑制物以验证miR-612在LncRNA OSER1-AS1调控增殖及凋亡中的作用可知：抑制miR-612的表达显著削弱敲低LncRNA OSER1-AS1抑制增殖、促进凋亡的作用。

图5 si-NC+miR-NC组、si-OSER1-AS1+miR-NC组、si-OSER1-AS1+miR-612组HepG2细胞存活率及凋亡率的比较 A：三组细胞存活率的比较；B：三组细胞凋亡的TUNEL染色；C：三组细胞凋亡率的比较。与si-NC+miR-NC组比较，*P<0.05；与si-OSER1-AS1+miR-NC组比较，#P<0.05

综上所述，HCC发病过程中高表达的LncRNA OSER1-AS1与低表达的miR-612具有负相关关系，高表达的LncRNA OSER1-AS1靶向抑制miR-612的表达并增加下游FOXM1的表达，进而促进癌细胞增殖、抑制癌细胞凋亡。本研究的上述结果初步揭示了LncRNA OSER1-AS1/miR-612/FOXM1轴在HCC发病中的作用，进而为今后研究HCC的发病机制提供了新思路。