臭氧熏蒸对玉米赤霉烯酮降解效果研究*

马一铭 张崇霞 张宇冲 朱延光 严晓平 周 庆

(中储粮成都储藏研究院有限公司 610091)

真菌毒素目前已被认为是食品安全中风险因素之一。其中玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种主要由镰刀菌属的菌株在粮食上寄生后产生的次级代谢产物毒素[1]，当环境湿度达到较高时该毒素容易产生[2]。该毒素广泛存在于各种谷物中，造成谷物形态变小和蛋白质的减少，同时，对人类和牲畜引起巨大的危害，可导致疾病和死亡[3]。有研究表明，玉米容易被真菌定殖并产生真菌污染[4]，玉米赤霉烯酮(ZEN)虽然主要是在收获前期产生，但如果玉米收获后储存在简易的储藏环境下，或者通风干燥风速过慢导致环境潮湿，玉米赤霉烯酮(ZEN)也会在此期间继续产生[5]。未加工的玉米中所含有的玉米赤霉烯酮(ZEN)达到了51 μg/kg～192 μg/kg，据EFSA(2014)报道称，儿童群体慢性饮食暴露在玉米赤霉烯酮中的含量达到了9.7 ng/kg～118 ng/kg，在成年人群体的含量达到了4.4 ng/kg～64 ng/kg。因此，急需要实用和高效的毒素降解措施降解粮食中真菌毒素，确保粮食安全，品质良好。

目前，清除玉米赤霉烯酮(ZEN)的方法主要包括物理、化学和微生物降解法。通过化学降解法虽然效率高效，但存在成本高、产生二次污染和改变食品营养成分的弊端。如今绿色高效的粮食保护方法广受粮食界的青睐，对生态环境的保护越来越受到人们的关注。臭氧作为自然界中广泛存在的气体，其降解产物为氧气，因此不用担心降解产物对环境的污染。同时臭氧作为强氧化物，对烯烃中的双键具有亲和力，可与多种化学物质发生反应[6]，破坏玉米赤霉烯酮毒素的分子结构，达到利用臭氧气体熏蒸粮食降解毒素的效果。随着电化学技术的发展，诸如质子交换膜和电解技术，让制造臭氧的途径更加高效和简易，仅需提供干燥空气或者纯氧气就可实现连续长时间的合成。作为环境友好的气体，臭氧熏蒸逐渐被作为一种降解真菌毒素的替代性技术。因此，在粮食上可以采用这种连续不断产生的高浓度臭氧对被真菌毒素污染粮食进行毒素降解[7]。

有研究表明，通过臭氧熏蒸被赤霉烯酮污染的玉米，能够使玉米赤霉烯酮(ZEN)毒素降解68.1%[1]。王轶凡等，通过20 mg/L的臭氧处理10 μg/mL的玉米赤霉烯酮(ZEN)溶液后，经测定处理后液体发现，产生了4种未知的稳定降解产物[8]。齐丽君等，向玉米赤霉烯酮(ZEN)标准溶液通入10 mg/L的臭氧，5 s后溶液中的ZEN被完全降解。同时，向含水量为14.1%的玉米籽粒中持续通入100 mg/L的臭氧，3 h后ZEN的降解率达到了86.0%，当玉米水分提高到19.6%时，采用相同的方法处理玉米籽粒后其ZEN降解率达到了90.7%[9]，表明臭氧降解玉米赤霉烯酮的效果与玉米含水量呈正相关关系。Alexandre A等人，利用臭氧熏蒸被玉米赤霉烯酮(ZEN)污染的玉米全粉，向被污染的玉米全粉中通入51.5 mg/L 的臭氧，20 min和60 min后发现玉米赤霉烯酮(ZEN)毒素降解率分别达到了60.2%和62.3%[10]。

1 材料与方法

1.1 玉米样品中玉米赤霉烯酮(ZEN)毒素含量测定方法

1.1.1 实验材料 去离子水，玉米赤霉烯酮(ZEN)流动相[乙腈-超纯水-甲醇(46∶46∶7，体积比)]，甲醇水(100%和80%)，磷酸缓冲液(PBS)，NaCl粉末。

1.1.2 实验仪器 电子天平(感量为0.0001g和0.01g)，氮吹仪，涡旋仪，离心管，粮食粉碎机，高效液相色谱仪(AGILENT 1260 Infinity Ⅱ)，色谱柱[AGILENT C18色谱柱(150 mm×4.6 mm:粒径4 μm)]，赤霉免疫亲和柱(ZearaStarTM-Immunoaffinity Columns)，离心机。

1.1.3 实验方法

1.1.3.1 玉米样品前处理 取出适量的玉米样品(约60 g～70 g)用粉碎机粉碎后过60目筛，取20.00 g样品放入100.00 mL离心管中备用，加入2.00 g NaCl与50.00 mL的80%甲醇水，在25℃环境下，用涡旋仪2000 r/min的参数涡旋30 min后得到样品液。将样品液用超纯水以2∶8的比例进行稀释后，用离心机以6000 r/min的参数离心5 min，取其上清液20.00 mL备用。将上清液通入赤霉免疫亲和柱(ZearaStarTM-Immunoaffinity Columns)后，弃掉滤液，再用10.00 mL的PBS清洗缓冲液过柱清洗，最后用10.00 mL的超纯水过柱清洗，弃滤液。用1.00 mL的100%甲醇洗脱免疫亲和柱两遍后，收集到洗脱液2.00 mL，用N2气吹干2.00 mL的甲醇洗脱液后，再用2.00 mL的流动相溶解。将流动相用液体滤膜过滤后，获得高效液相色谱(HPLC)待测液。

1.1.3.2 液体样品前处理 将待测液体20.00 mL通入赤霉免疫亲和柱(ZearaStarTM-Immunoaffinity Columns)后，弃掉滤液，再用10.00 mL的PBS清洗缓冲液过柱清洗，最后用10.00 mL的超纯水过柱清洗，弃滤液。用1.00 mL的100%甲醇洗脱免疫亲和柱两遍后，收集到洗脱液2.00 mL，再用N2气吹干2.00 mL的甲醇洗脱液后，再用2.00 mL的流动相溶解。将流动相用液体滤膜过滤后，获得高效液相色谱(HPLC)待测液。

1.1.3.3 测定玉米赤霉烯酮(ZEN)毒素含量 将高效液相色谱仪的参数设为：流速1.0 mL/min，柱温35℃，进样量为20 μL，玉米赤霉烯酮检测波长中，激发波长为274 nm，发射波长为440 nm，最终根据测得峰面积计算出毒素含量。

1.2 实验室内臭氧处理玉米赤霉烯酮实验

1.2.1 实验材料 无杂质玉米籽粒，玉米赤霉烯酮(ZEN)标准品(100 mg/瓶)，去离子水。

1.2.2 实验仪器 臭氧发生器，AL204分析天平，50 mL容量瓶，200 μL移液枪，1000 μL移液枪，涡旋震荡仪，玻璃瓶，加丝自封口袋，臭氧破坏器，蒸馏水曝气瓶，硅胶干燥瓶，不锈钢三通阀，铁架台，硅胶管道，亚力克密封试验管，臭氧浓度检测仪，玻璃转子流量计，变色硅胶。

1.2.3 实验方法

1.2.3.1 臭氧降解玉米赤霉烯酮(ZEN)标准品溶液实验 臭氧降解玉米赤霉烯酮(ZEN)标准品溶液毒素的装置图如图1所示，每次使用前先开机检查各个连接口的气密性情况和变色硅胶气体干燥瓶情况，如有漏气则重新连接，变色硅胶干燥剂若已经完全变色，则需要替换干燥好的硅胶。试验开始前先准备1 mg/L的玉米赤霉烯酮(ZEN)标准品溶液100 mL并倒入曝气瓶中再接入阀门B的通道中，关闭标准品溶液的阀门B，打开空瓶的阀门A，先开启臭氧尾气破坏装置和臭氧浓度检测仪，再开启臭氧发生装置，通过玻璃转子流量计观察当气体流量稳定为3.5 L/min，并且臭氧浓度检测仪读数稳定在100 mL/m3(±10)时，关闭阀门A同时打开阀门B让气体缓慢通过玉米赤霉烯酮溶液，并开始计时，当通入时间分别达到了5 s、10 s、15 s、20 s、30 s、40 s、50 s、30 min时，立即停止计时，关闭臭氧发生装置、阀门B和打开阀门A，并从经臭氧处理一定时间的玉米赤霉烯酮溶液的瓶中移取10 mL样液，装入离心管做好对应标记待测毒素含量。按照以上步骤重复操作直至完成所有实验。用HPLC高效液相色谱测定不同处理时间的样液中玉米赤霉烯酮(ZEN)含量，每样品测定3次，并记录测定结果。

1.2.3.2 玉米籽粒加标玉米赤霉烯酮(ZEN)毒素 从去除杂质的玉米籽粒中挑选形态完整无破损的玉米完善籽粒，测定玉米初始平均水分为12.79%，并用自封口袋分装成1200 g和900 g两袋样品，用量筒量取15 mL(考虑水分损失)去离子水喷洒至装有900 g玉米粒的自封口袋中，待水分平衡几天后，测定其最终水分为13.68%。用量筒量取67 mL(考虑水分损失)去离子水喷洒至装有1200 g玉米粒的自封口袋中，待水分平衡几天后，测定其最终水分为18.11%。

将1 mg玉米赤霉烯酮(ZEN)粉末完全溶解于10 mL纯乙腈水中，再将ZEN-乙腈溶液用容量瓶添加去离子水定容至50 mL，配制成20 μg/mL的玉米赤霉烯酮(ZEN)20%乙腈水溶液静置均匀后备用。将事先准备好的水分为13.68%的900 g玉米粒样品中加入10.5 mL已配制好的20 μg/mL的玉米赤霉烯酮(ZEN)溶液，将自封袋口封好后均摇加标玉米粒数次，直至自封袋表面无明水后放入常温下静置数日。再向水分为18.11%的1200 g玉米粒样品中加入9.2 mL已配制好的20 μg/mL 的玉米赤霉烯酮(ZEN)溶液，将自封袋口封好后均摇加标玉米粒数次，直至自封袋表面无明水后放入常温下静置数日。测定混毒后的 900 g 和1200 g袋装玉米籽粒中玉米赤霉烯酮的含量，分别为107.33 μg/kg和93.22 μg/kg。将测定后的样品放入冰箱冷藏备用。

1.2.3.3 臭氧降解毒素加标玉米籽粒中玉米赤霉烯酮(ZEN)试验 臭氧降解玉米籽粒中玉米赤霉烯酮(ZEN)的装置图如图2所示，每次使用前先开机检查各个连接口的气密性情况和变色硅胶气体干燥瓶情况，如有漏气则重新连接，变色硅胶干燥剂若已经完全变色则需要替换干燥好的硅胶。臭氧熏蒸开始时检查臭氧浓度检测仪的浓度在1401(±100)mL/m3的范围内。当浓度稳定后，实验期间保持臭氧气体流速为4.5 L/min，并每隔0.5 h查看臭氧浓度是否在试验浓度范围内，若有偏差则及时校准至正确范围。

将毒素含量为107.33 μg/kg的加标玉米中每次取200 g样品至亚克力试验管中(如图2所示)，密封好试验管后用1401(±100)mL/m3的臭氧对加标玉米籽粒进行连续熏蒸处理，在常温(25℃)环境下分别连续熏蒸4 h和8 h，再用间隔熏蒸模式，先用臭氧熏蒸4 h后停机间隔20 h后继续用臭氧熏蒸4 h，最后在冷藏室低温环境(-4℃)中用臭氧熏蒸8 h。所有处理完成后样品散气24 h，测定玉米籽粒中玉米赤霉烯酮(ZEN)的含量，并记录实验结果。

以同样的方法将毒素含量为93.22 μg/kg的加标玉米中每次取200 g样品至亚克力实验管中(如图2所示)，密封好试验管后用1401(±100)mL/m3的臭氧对加标玉米籽粒进行连续熏蒸处理，在常温(25℃)环境下分别连续熏蒸4 h和8 h，再用间隔熏蒸模式，先用臭氧熏蒸4 h后停机间隔 20 h 后继续用臭氧熏蒸4 h。所有处理后样品散气24 h后，测定玉米籽粒中玉米赤霉烯酮(ZEN)的含量，并记录实验结果。

图2 臭氧降解毒素加标玉米籽粒中玉米赤霉烯酮(ZEN)实验装置示意图

根据不同样品和臭氧处理方式分析臭氧对玉米赤霉烯酮(ZEN)的降解率情况。

2 结果分析

2.1 臭氧降解玉米赤霉烯酮(ZEN)标准品溶液毒素实验结果

臭氧为一种强氧化剂，能让毒素的分子结构被氧化而破坏，试验期间保持臭氧通入浓度为100±10 mL/m3，臭氧流速为3.5 L/min，当臭氧处理 5 s、10 s、10 s、15 s、20 s、30 s、40 s、50 s、1800 s(30 min)时暂停气体通入并抽取10 mL处理液用于检测毒素含量，毒素浓度检测每次进样3次，检查结果如表1所示。从图3中可看出臭氧对玉米赤霉烯酮(ZEN)的降解率随处理时间递增而逐渐增加，当处理时间达到30 min时，溶液中玉米赤霉烯酮被完全降解。表明臭氧对玉米赤霉烯酮毒素具有快速的降解作用。

表1 臭氧不同时间处理玉米赤霉烯酮溶液后毒素浓度含量情况

图3 100±10 mL/m3臭氧降解玉米赤霉烯酮(ZEN)的降解率随时间变化情况

2.2 臭氧降解毒素加标玉米籽粒中玉米赤霉烯酮(ZEN)实验结果

通过用玉米赤霉烯酮标准品液对两种水分且不含玉米赤霉烯酮毒素的玉米完整粒进行毒素加标后，放入试验设施中采用1401±100 mL/m3的臭氧浓度在不同温度和处理时间情况下对加标玉米进行通气处理，处理完成后从每批处理样品中随机抽取 100 g 籽粒进行玉米赤霉烯酮含量检测，每批样品重复取样检测3次。不同方式处理后毒素含量情况如表2所示。从图4A可以看出，臭氧连续处理时间越长毒素降解越多，表明玉米籽粒的毒素含量随着通入臭氧时间会逐步降低。从图4A、

表2 不同条件下臭氧降解两种水分的玉米粒中玉米赤霉烯酮毒素情况

B中可以看出，当玉米籽粒水分含量越高，臭氧对玉米赤霉烯酮毒素的降解率显著提高，表明含水量高低影响臭氧降解毒素效率。从图4C中可以看出，低温条件(-4℃)下不利于臭氧降解玉米赤霉烯酮毒素，导致其降解效率显著减慢。从图4B中可以分析得出，低水分的玉米(13.68%)以连续4 h+间隔20 h+连续4 h的方式处理比以连续8 h的ZEN毒素降解率显著增加，但同样的两种处理方式对高水分的玉米(18.11%)没有显著的降解率差异。

A.臭氧降解不同湿度玉米中毒素效果

图4采用1401±100 mL/m3臭氧浓度处理含玉米赤霉烯酮的玉米样品后的降解率情况。图中不同小写字母(a,b,c)表示不同处理之间的降解率差异性是否显著。图4A标注为：玉米水分-连续臭氧处理时间；图4B标注为：玉米水分-臭氧处理方式，即连续是采用臭氧连续通入8 h，间隔是采用臭氧连续通入4 h后停止通气20 h后再继续通入4 h；图4C标注为：臭氧处理的环境温度-臭氧处理时间。

3 讨论

通过臭氧降解玉米赤霉烯酮室内实验表明，臭氧对玉米赤霉烯酮具有快速的降解效果，臭氧气体通入含有玉米赤霉烯酮的溶液中，能够快速与其反应最终将其降解。对玉米籽粒的加标实验表明，玉米对玉米赤霉烯酮具有一定的吸收作用，向洁净的玉米籽粒中加入玉米赤霉烯酮溶液能测出籽粒含有玉米赤霉烯酮，而且将样品与玉米赤霉烯酮溶液混合均匀后可让籽粒被均匀加标。因此，用该种办法加标玉米能保证样品毒素含量均匀，使标样适用于毒素降解试验。

从臭氧处理玉米赤霉烯酮的加标样品的实验可看出，臭氧对玉米加标样品中的玉米赤霉烯酮降解率，因不同臭氧处理条件而呈现不同的差异。实验表明低温将大幅度降低臭氧处理毒素的效率，因此选择晴朗温暖的天气对储粮进行臭氧处理，将提高毒素降解效果。

从对比实验结果可以看出，含水量越高的玉米将越有利于提高臭氧降解玉米赤霉烯酮的效率。因此，玉米含水量对臭氧处理效果具有显著的影响，对于高水分的储粮为了防止粮食霉变和真菌毒素的产生，可以进行臭氧熏蒸处理有效地降低真菌毒素。

在臭氧处理模式方面，通过连续+间隔处理，可小幅度地提升含水量较低的玉米的臭氧降解效率，但对于高水分玉米降解率的提升效果却不显著。

4 结论

通过臭氧处理玉米赤霉烯酮溶液的实验表明，臭氧对玉米赤霉烯酮具有明显的降解效果，100 mL/m3的臭氧可在1 min钟内能将1 μg/mL玉米赤霉烯酮降解84%以上。

采用1401±100 mL/m3浓度的臭氧连续处理玉米赤霉烯酮加标样品，结果表明，臭氧可有效降解含有玉米赤霉烯酮的玉米籽粒，且降解效果受到不同处理条件的影响。其中玉米含水量和处理时的环境温度对臭氧降解效果影响较大，含水量为18.11%的高水分玉米比含水量为13.68%的低水分玉米，降解率高出18%～23%，可能是由于臭氧具亲水反应效果，臭氧气体可溶于水产生氧化自由基，因此，相比低水分的玉米籽粒，可快速与高水分玉米籽粒中的毒素反应。相比常温条件，在低温下臭氧降解率显著降低了21.5%，表明低温不利于臭氧与玉米赤霉烯酮反应，可能因为臭氧与玉米赤霉烯酮的化学反应为吸热反应，低温不利于反应的快速进行，因此低温条件下反应速度较慢。