真菌毒素测试仪应用及校准方法的研究

周华文 王光跃 王晓红

摘要：真菌毒素是指丝状真菌在粮食和饲料中生长产生的有毒次级代谢产物，极易污染各类农产品，对人体和动物危害极大;真菌毒素测试仪是一种快检仪器，可以对粮食存放产生的真菌毒素含量进行快速有效的测量，对食品、饲料安全检测初筛发挥着重要的作用;真菌毒素测试仪的量值准确性直接关系到粮食初筛的科学与否。论文简单分析了真菌毒素测量的重要性和现阶段真菌毒素测试仪的校准状况;通过分析真菌毒素测试仪的各项技术指标，找出关键量值的评价方法，确定了真菌毒素测试仪的校准方法。

关键词：真菌毒素 校准方法 粮食安全

Mycotoxin Tester Application and Research on Calibration Method

Zhou Huawen1 ， Wang Guangyue1，Wang Xiaohong2

（1. Binzhou Inspection and Testing Center; 2. Shandong Yuntang Intelligent Technology Co.， LTD）

Abstract： Mycotoxins are toxic secondary metabolites produced by filamentous fungi growing in grain and feed. It is very easy to pollute all kinds of agricultural products，great harm to human body and animals. Mycotoxin tester is a fast detection instrument， which can quickly and effectively measure the content of mycotoxin produced by grain storage，and plays an important role in the preliminary screening of food and feed safety detection. The accuracy of mycotoxin tester is directly related to the qualification of primary screening of food and feed.This paper briefly analyzes the importance of mycotoxin measurement and the calibration of mycotoxin tester at present. By analyzing the technical indexes of mycotoxin tester， the evaluation method of key quantity value is found out，and the calibration method of mycotoxin tester is determined.

Key words： mycotoxins， calibration method， food safety

0 引言

當前国家粮食供给处在紧平衡状态，疫情下粮食出口国停止出口，当下仓储粮的安全事关粮食安全的关键。目前真菌毒素已知种类有400余种，我国GB 2761—2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》、GB 13078—2017 《饲料卫生标准》都对脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉素B1、黄曲霉素M1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉素、展青毒素做出了限量要求;真菌毒素测试仪是一种快检仪器，由于真菌毒素快速检测仪器的检测速度快、检测成本低等特点，在市场、家庭、食堂餐厅等领域应用广泛，提升了食品安全检测的效率，扩大了食品检测的范围，对于更科学有效的管理食品安全市场发挥重要的作用;真菌毒素测试仪的正确使用及该设备的量值准确可靠是控制粮食不受感染的重要保障。

1 真菌毒素测试仪在粮食安全中的重要性

真菌毒素测试仪应用于粮食收储企业、食品制造业、牲畜饲料生产业，特别是粮食收储企业，因粮食饲料在收获时未被充分干燥或贮运过程中温度或湿度过高，都可能使粮食饲料上的真菌迅速生长，真菌毒素就是真菌生长产生的有毒次级代谢产物。几乎所有在粮食仓库中生长的真菌（仓贮真菌）都侵染种胚造成谷物萌发率下降，同时产生毒素。这都需要使用真菌毒素测试仪进行实时检测和控制。因此，真菌毒素测试仪的使用和校准必须准确可靠。

2 常见的两种真菌毒素测试仪

2.1 荧光定量免疫层析技术检测法真菌毒素测试仪

定义：免疫层析技术又名侧向流免疫层析，是一种色谱分析技术。该技术是将已知的抗原或抗体预先偶联到载体上作为捕获线，待检测样本在载体的毛细作用带动下流经捕获线，若样本中存在相应的抗体或者抗原，就能和载体上的抗原或抗体发生特异性反应而吸附到载体上，并通过标记物显色或者发光以确定是否含待测物或者待测物的含量。

荧光免疫层析技术，是将免疫荧光技术和免疫层析技术相结合发展创新的一种定量新型检测技术。该技术是用荧光微球与抗体结合形成荧光标记抗体，通过抗原抗体反应对待测物进行检测。该技术不但保留胶体金免疫层析技术操作简便、检测快速、便携性强的优点外，还通过荧光示踪增强技术实现了检测结果的精确定量。

荧光定量免疫层析技术是在荧光免疫层析技术的基础上，通过荧光定量检测仪对待测物进行定量检测。免疫微球标记的荧光物质在特定波长光的照射下会发出荧光，仪器会根据荧光的发光强度，通过仪器预置的标准曲线，对待测物质做到定量检测。

2.2 胶体金定量检测法真菌毒素测试仪

粮食行业标准LS/T 6111—2015《粮油检验 粮食中黄曲霉毒素B1测定 胶体金快速定量法》、LS/T 6112—2015《粮油检验 粮食中玉米赤霉烯酮测定 胶体金快速定量法》、LS/T 6113—2015《粮油检验 粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定 胶体金快速定量法》、LS/T 6114—2015《粮油检验 粮食中赭曲霉素毒素A测定 胶体金快速定量法》要求的胶体金快速定量技术，免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique）是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4 ）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下， 聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金层析抗原抗体反应在纤维素膜上，从而使标记胶体金的抗体在检测线、质控线上聚集， 从而形成可以被肉眼观察到的红色条带。

胶体金定量免疫层析技术是在胶体金免疫层析技术的基础上通过胶体金定量检测仪对待测物质进行定量检测。胶体金定量检测仪通过对胶体金检测卡的检测线和质控线进行光密度扫描，依据检测线和质控线颜色的深浅，通过仪器预置的标准曲线对待测物质进行定量检测。

3 胶体金定量检测法与荧光定量免疫层析技术检测法本质区别

3.1 标记技术不同

荧光定量免疫层析产品以功能化纳米微球为载体技术，结合荧光标记物探针，仪器直接检测激发荧光信号而非传统金标定量所采用的CCD表层光密度扫描技术。检测信号具有较高的信噪比、更高的信号检测量和检测灵敏度。

3.2 载体结合方式不同

胶体金免疫层析技术采用物理吸附的方法结合，抗原/抗体容易从金颗粒表面脱离，标记物不稳定。由于胶体金技术的原理缺陷和无法攻克的技术难点，故胶体金免疫层析技术，通常适用于定性或者半定量现场快速检测，无法给出精准定量的检测结果。荧光免疫层析技术采取的是化学偶联的吸附方法，抗原/抗体结合能力强，不易脱落，检测结果较为精准。两种检测方法对比情况见表1。

4 真菌毒素测试仪的正确使用

毒素荧光定量快速检测卡具有方便、快速、灵敏等特点，适用于现场大批量样品检测。本试剂将毒素包被抗原在硝酸纤维素膜上划线包被，作为检测线，用羊抗兔多抗在硝酸纤维素膜上划线包被制成质控线。将鼠抗毒素单克隆抗体标记上乳胶荧光微球与兔IgG标记的乳胶荧光微球混匀后喷涂在玻璃纤维素膜上制备成标记物垫。硝酸纤维素膜靠近质控线的一端覆盖上吸水垫，靠近检测线的另一端覆盖标记物垫。往标记物垫上加入标准品溶液或待测样本提取液，抗原就会与标记物混合反应并沿着硝酸纤维素膜层析，分别与检测线和质控线反应。当测试结果有效时，质控线显示一定光强度。这时检测线上的光信号强度与质控线上的光信号强度的比值（T/C）与样本浓度呈负相关，通过标准曲线计算即可得出待测样品浓度。

除严格按仪器说明操作外，不同批号的试剂和检测卡不能混用，检测卡干燥保存;加样操作应快速准确手法一致，溶液不能沾到壁上，尽量缩短整个加样时间 ，加样完毕后将检测卡水平静置于恒温器中等待层析反应，严格控制反应时间， 检测卡开封后立即使用，一次性使用的检测卡不得重复使用，检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染。样品、洗弃液和各种废弃物处理都应符合实验室废弃物处理办法并尽快处理。

5 真菌毒素测试仪的校准

5.1 现状

真菌毒素测试仪的生产没有相应国家标准，没有统一的仪器校准规范，不能对不同厂家研发生产的同类型仪器的计量性能进行统一规范，不能保证仪器量值准确性，从而影响到对谷物中真菌毒素的含量控制，进而影响食品安全;食品安全不仅关系到广大人民群众的身体健康和生命安全，而且与经济的健康发展和社会的和谐稳定密切相关。目前没有发现有机构开展真菌毒素测试仪相关的检测校准，也没有相关的真菌毒素测试仪校准的文献。

5.2 制定校准方法的意义

校准规范的制定一是可解决仪器无统一校准规范的问题，保证各计量机构采用统一的标准物质或标准计量器具，按统一的校准方法进行校准，为仪器量值准确可靠提供技术保障;二是通过规范制定后开展定期的校准活动，使仪器得到正常維护，保证检测仪器的计量特性指标符合相关标准的基本参数要求;三是通过制定规范，为相关仪器的生产、验货交易、纠纷仲裁等提供可供参考的技术依据。

5.3 真菌毒素测试仪的校准步骤

5.3.1 以乙腈中脱氧雪腐镰刀菌烯醇溶液标准物质的稀释液为平行样，以真菌毒素测试仪测试其荧光值，按照公式（1）得到拟合曲线，然后根据其测量值，按照式（2）计算相关系数。

式中：

x——稀释液浓度值;

y——荧光值;

b——拟合曲线斜率;

a——拟合曲线截距;

r——相关系数;

xi——第i个浓度点稀释液浓度值;

yi——第i个浓度点荧光值;

x ——稀释液浓度值的平均值;

y ——荧光值的平均值。

5.3.2 计算测量重复性：重复测量中浓度的乙腈中脱氧雪腐镰刀菌烯醇溶液标准物质的稀释液的荧光值，计算实验标准偏差s。

5.3.3 计算最小检出值：重复测量空白样品的荧光值，取荧光值的平均值为y，取y-3s作为最小检出值。

6 结束语

本文分析了真菌毒素测量的重要性和真菌毒素测试仪工作原理以及现阶段真菌毒素测试仪的校准状况;通过分析真菌毒素测试仪的各项技术指标，实现了对真菌毒素测试仪的校准工作，解决了真菌毒素测试仪不能校准的难题;该方法主要使用的是国家二级标准物质，能够满足扩展不确定度小于被校准设备最大允许误差的1/3的要求，对真菌毒素测试仪要求合理、切实可行，可操作性强。

参考文献

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