Dysbindin转基因小鼠心肌肥厚模型中基因变化

蒋珍妮 朱国能 王迎超 赵文胜

心肌肥厚是高血压、心肌病、心肌梗死等众多心血管疾病共同经历的病理过程，是心力衰竭的独立危险因素和不良预后的信号［1］。其对多种心血管刺激因素所做出的适应性代偿反应；长期应激会导致心肌病理性肥大伴随有心脏形态和功能上的恶化，最终导致心肌缺血、恶性心律失常、心力衰竭甚至猝死。因此心肌肥厚模型在揭示心力衰竭发生、发展规律，研究心力衰竭的预防和治疗中发挥重要作用。心肌肥厚的发生机制尚未完全明确。证据显示，Dysbindin的表达异常和心肌肥厚的发生密切相关［2-3］，建立Dysbindin转基因小鼠心肌肥厚模型，对研究心肌肥厚及早期干预、防治心血管事件起到有益的作用［4］。本实验复制两种心肌肥厚模型：异丙肾上腺素（isoproternol，ISO）和胸主动脉缩窄（thoracic aorta constriction，TAC），比较Dysbindin转基因小鼠心肌肥厚标志基因的表达。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级C57BL/6小鼠，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司［SCXK（沪）2007-0005］；小鼠繁殖和饲养在浙江中医药大学实验动物［SYXK（浙）2018-0012］和浙江大学医学院附属第二医院［SYXK（浙）2015-0010］。生产许可证，饲养许可证，遵循中国动物饲养条例。实验小鼠的饲养过程和实验操作均符合实验动物伦理学要求（审批号：2016-042）以及中华人民共和国《实验动物管理条例》。

1.2 主要实验试剂和仪器 pUC57-Amp载体（GENEWIZ）、小量质粒提取试剂盒和中量治理提取试剂盒（Qiagen）、PCR试剂盒（Invitrogen）、RNAiso Plus试剂盒（Takara）、SYBR Green Master Mix（Bioteke）、EDTA（Sigma公司）、戊巴比妥钠、异丙肾上腺素（上海禾丰制药）等。超净工作台（苏州净化设备厂）、OlympusIX-71荧光显微镜、OlympusSZ61体视显微镜、Nanodrop2000（Thermo）、CFX 荧光定量PCR仪（BioRad）、ALC-V8S小动物呼吸机（上海奥尔科生物科技有限公司）等。实验方法：（1）建立Dysbindin转基因小鼠 查询NCBI和ENSEMBL的人Dysbindin（CCDS4534）和cTNT启动子序列，构建cTNT-Dysbindin-IRES-EGFP-polyA质粒，经PCR扩增测序（上海生物工程公司），证实后受精卵原核显微注射，产下仔鼠39只。鉴定阳性9只（4只雄性，5只雌性）为首建鼠（邦耀生物合成）。首建鼠分别与野生型小鼠交配6～7代以上，纯化小鼠品系的遗传背景。（2）小鼠ISO模型：10～12周雄性小鼠，将体重为24～26 g的小鼠纳入实验，按转基因小鼠和野生型小鼠1∶1配对，各16只。分为对照组与ISO组，ISO组皮下注射盐酸异丙肾上腺素1 mg/kg，2次/d，间隔8 h，连续2周。对照组皮下注射相同体积的0.9%氯化纳溶液。末次给药后24 h取材。（3）小鼠TAC模型：10～12周雄性小鼠，将体重为24～26 g的小鼠纳入实验，预估TAC模型死亡率20%～30%，转基因小鼠和野生型小鼠各23只。使用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg），腹腔注射麻醉小鼠；固定小鼠上门齿于手术板，轻外拉小鼠舌，将气管插管经声门轻柔插入气管内，连接呼吸机，呼吸机的频率与小鼠的胸廓起伏一致提示气管插管已成功。垫高小鼠胸廓，消毒胸部皮肤，剪开左胸部皮肤，分离组织，沿第2～3肋间打开胸腔，拨开左肺，分离胸主动脉，将6-0手术缝线穿过血管，在血管上方平行放置一段去尖的26G针头，将血管及针头一起结扎，抽出针头即达到相应程度的缩窄（约70%缩窄）。结扎后，滴入数滴青霉素液，关闭胸腔，用注射器从缝合处插入胸腔并抽出0.5 mL气体，逐层缝合。假手术组（sham组）在游离胸主动脉后只穿线，不结扎，其他操作步骤与TAC组一致。术后6周取材。（3）计算心脏重量指数 小鼠称重后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开皮肤、横隔，剪除胸骨和肋骨，暴露肺和心脏，夹住左心耳下方的血管蒂，修剪心脏组织于4℃PBS液中清洗，无菌纱布吸干液体，称量记录心脏重量，液氮冷冻，保存在-80℃冰箱。心脏重量指数（HW/BW）=心脏重量（mg）/体重（g）。（4）心肌肥厚标志基因检测：冻存心肌心脏研磨后，按照RNAiso Plus试剂盒操作指南提取总RNA，Nanodrop测定纯度和浓度，反转录为cDNA，qRT-PCR检测心肌肥厚的标志基因：心房利钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）和-肌球蛋白重链（-myosin heavy chain，-MHC）。引物序列［5］：ANP F：5'ACAGCCAAGGAGGAAAAGGC3'R：5'CCACAGTGGCAATGTGACCA3'；BNP：F：5'TCCAGAGCAATTCAAGATGCA3'R：5'CTTTTGTGAGGCCTTGGTCC3'；-MHC：F：5'GATGTTTTTGTGCCCGATGA3'R：5'ACCGTCTTGCCATTCTCCG3'。GAPDH：F：5'GAAGGGCATCTTGGGCTACA3'R：5'GTGAGGGAGATGCTCAGTGTT3’。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计量资料以（±s）表示。组间比较用单因素方差分析，方差不齐时用Tamhane检验，方差齐性时用LSD检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转基因小鼠鉴定 转基因小鼠出生3周剪鼠尾巴，PCR扩增，产物送上海生物工程公司测序，与GenBank的序列进行blast比对。随机抽取阳性转基因小鼠取脑、心、肺、肝、脾、肾脏和骨骼肌，荧光显微镜下观察，dysbindin转基因小鼠仅特异地表达在心肌组织。

2.2 心肌肥厚模型存活率 ISO模型32只小鼠2周后全部存活。TAC模型46只小鼠入组，术后6周野生型存活11只，转基因组12只（存活率分别73%和80%）。

2.3 HW/BW比较 ISO模型中，对照组转基因小鼠和野生型小鼠分别为（4.27±0.06）mg/g和（4.27±0.04）mg/g，差异无统计学意义（P＞0.05）。ISO组转基因小鼠和野生型小鼠为（5.09±0.05）mg/g和（5.43±0.09）mg/g，明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；转基因小鼠较野生型小鼠降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。TAC模型中，sham组转基因小鼠和野生型小鼠分别为（4.24±0.04）mg/g和（4.29±0.06）mg/g，差异无统计学意义（P＞0.05）。TAC组转基因小鼠和野生型小鼠为（5.11±0.14）mg/g和（7.09±0.07）mg/g，明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；转基因小鼠较野生型小鼠降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 两种模型心肌肥厚标志基因比较 对照组和sham组中转基因小鼠和野生型小鼠的心肌肥厚标志物基因表达均差异无统计学意义（P＞0.05）。ISO组和TAC组转基因小鼠和野生型小鼠比相应的对照组均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；而转基因小鼠心肌肥厚标志物升高程度低于野生型小鼠，除BNP外，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 心肌肥厚标志基因

3 讨论

转基因技术是现代生命科学研究的重要方法之一，在动物转化研究中发挥重要作用。受精卵原核显微注射法具有可直接转移不含有原核载体DNA片段的外源基因、长度不受限制、实验周期相对短和整合率高等特点，是目前最常用最有效的一种基因转移方法。通过制作结扎雄鼠、受精卵供体雌鼠、假孕母鼠、显微注射和胚胎移植，作者成功建立首建鼠，与野生型小鼠交配6～7代以上，纯化小鼠品系的遗传背景，共育转基因小鼠的阳性率达80%。

心肌肥厚与细胞信号通路的激活密切相关。已知信号通路有MAPK（mitrogen-activated protein kinases，丝裂原活化蛋白激酶）信号通路、AMPK（AMP-activated protein kinase，腺苷酸激活蛋白激酶）信号通路、Wnt信号通路、JAK-STAT（Janus Kinase-Signal transducer and Activator of Transcription，Janus酪氨酸激酶-信号转导子和转录激活子）信号通路等，其互相作用调节转录过程及细胞周期，调节各自下游的靶基因转录，刺激表达相关基因，导致心肌肥厚。因此心肌肥厚的机制非常复杂，复杂性取决于研究模型、病理刺激以及不同物种对刺激的反应性差异。在不同因素诱导下，心肌肥厚的分子表型可能不同［6］。

ANP是由心房肌细胞合成并释放的肽类激素；BNP由心室肌细胞合成，心室负荷和室壁张力改变是刺激BNP分泌的主要条件。肌球蛋白是心肌粗细肌丝的主要成分，由两条重链（α-MHC和-MHC）和两对轻链构成。当心肌肥厚时，-MHC mRNA 表达明显增强，α-MHC向-MHC转化，因此-MHC是心肌肥厚的一个重要的标志性基因［7］。有研究发现不同心肌肥厚模型的基因表达谱存在差异［8］。TAC模型小鼠心肌肥厚有早期的代偿性向心性肥厚和晚期的失代偿性离心性肥大及心力衰竭两个阶段，在早期代偿性心肌肥厚的进程中，磷酸化细胞外调节蛋白激酶（The extracellular signal-regulated kinases 1/2，ERK1/2）被激活［9］。ISO属于β受体激动剂，激活交感神经系统，有研究发现ISO模型中磷酸化氨基末端蛋白激酶（Phospho-c-Jun-NH2-terminal-Kinase，P-JNK）等增加［10］。ERK1/2和JNK是MAPK信号通路中的两种分支，提示TAC模型和ISO模型可能通过MAPK家族信号通路中不同分支通路，导致心肌肥厚。

作者建立的Dysbindin转基因小鼠，含有cTNT启动子，具有心脏特异性表达，可用于心脏模型的研究。Dysbindin是富含心肌闭锁连接蛋白-1相关蛋白（Myocardium-enriched zonula occludens-1-associated protein，Myozap）的分子伴侣，参与Rho相关的血清反应因子（Rho-dependent serum response factor，SRF）和ERK1/2介导的心肌肥厚，在心肌细胞信号转导中起重要作用［11］。ERK1/2功能和细胞增殖分化有关，ERK1/2活化是将信号从细胞膜表面受体转导至核的关键。其上游信号是Ras/Raf蛋白，该MAPK分支信号通路Ras/Raf-MEK-ERK中关键因子有Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2蛋白，任何一种蛋白功能异常会导致细胞生长分化异常。本研究结果提示，Dysbindin转基因小鼠对于ISO和TAC诱导心肌肥厚均有减轻作用，除BNP表达外，差异均有统计学意义。Dysbindin转基因小鼠在ISO和TAC诱导心肌肥厚模型中作用机制尚不明，可能与MAPK信号通路有关，具体待进一步研究证实。