AHLs投加方式对好氧颗粒污泥稳定性的影响

宋志伟， 郑 欢， 谷新宇

(1.黑龙江科技大学 教务处， 哈尔滨 150022； 2.黑龙江科技大学 环境与化工学院， 哈尔滨 150022)

0 引 言

好氧颗粒污泥(Aerobic granular sludge，AGS)相比于传统絮体污泥具有更好的沉降性、更高的污泥浓度且能同步脱氮除磷[1]。不过，进水水质、接种污泥种类、微生物功能紊乱等因素的恶化都会导致AGS出现解体、破碎[2]。如何快速形成稳定的AGS，避免颗粒解体、污泥上浮、污泥除污性能下降等问题，将成为解决AGS在实际应用中瓶颈的关键[3]。因此，AGS稳定性定向调控研究，可为AGS在实际应用中提供稳定运行的理论参考。

AGS实质上是微生物在适宜的条件下通过自凝聚作用而形成的颗粒状生物聚合体，通常被认为是一种特殊结构的微生物被膜[3]。AGS主要由微生物以及微生物分泌的胞外聚合物(Extracellular polymeric substances，EPS)组成，其中EPS占污泥干重的10%～40%[4]。EPS主要由多糖(Polysaccharides，PS)、蛋白质(Protein，PN)组成。EPS中的蛋白质和脂质可以维持污泥结构的稳定，并提高污泥的絮凝沉降性。同时，多糖含有大量羟基、羧基等亲水官能团，通过吸附架桥等作用使游离细胞交联与固定，同样提高了污泥的絮凝能力[5-7]。研究表明，EPS中的PS、PN相对质量分数的减少会引起AGS的疏水性、结构改变，进而导致颗粒的解体[8]。Zhang等[9]研究发现，利用群体感应现象(Quorum sensing，QS)可以增强微生物ATP的合成来提高颗粒稳定性，并且ATP的质量分数与EPS质量分数呈正相关关系。而QS广泛存在于絮体污泥、厌氧颗粒污泥、好氧颗粒污泥等污水处理系统中[10-12]，因此，利用QS来改变EPS的组成是实现定向调控AGS稳定性的重要手段。研究发现，投加C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL三种N-乙酰基高丝氨酸内酯类化合物(N-acyl homoserine lactones，AHLs)对AGS稳定性有明显的促进作用，且C12-HSL效果最显著[13]。然而，在这些研究中主要采用单一的AHLs投加方式，缺少在不同AGS培养时期投加不同类型AHLs的这类混合投加方式，以及探讨AHLs类型的改变对AGS中EPS组分的影响。

笔者按不同AGS培养时期先后投加C12-HSL、C14-HSL两种AHLs的方式，监测反应器运行过程中平均粒径、污泥浓度、EPS相对质量分数、EPS荧光组分、EPS官能团的变化，探究AHLs投加方式对EPS中组分以及对AGS稳定性的影响，补充定向调控AGS稳定性的信号分子投加方式，突破AGS实际应用中的瓶颈。

1 材料与方法

1.1 实验装置

如图 1所示，采用自制气升式内循环序批式反应器(Sequencing batch airlift reactor，SBAR)，内管内直径0.08 m，外管内直径0.24 m，高0.12 m，厚0.002 m，内管注水高度1 m，实际反应有效容积为5 L。反应器主体由有机玻璃制成，配有温度、水位传感器并用于PLC集成自动控制。内管底部置有曝气装置，由电磁真空泵供气，曝气量由气体转子流量计控制。运行方式为序批式连续运行。

图1 SBAR实验装置Fig. 1 Schematic diagram of SBAR installation

1.2 实验材料

接种污泥取自哈尔滨啤酒厂污水处理二沉池回流的絮体污泥。污泥呈褐色絮状，优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)，颗粒平均粒径为0.064 mm，混合液悬浮固体质量浓度(MLSS)为123 13 mg/L，污泥体积指数(SVI30)为78.0 mL/g。

实验用水采用配制模拟工业废水，其CODcr、TP、NH3-N质量浓度控制在1 450～1 550、5.5～6.5、90～105 mg/L。配制所用试剂：无水氯化钙(CaCl2)、七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化铵(NH4Cl)、七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、牛肉膏、葡萄糖、蛋白胨；微量元素：硼酸(H3BO4)、钼酸钠(NaMoO4)、七水合硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、氯化镍(NiCl2)、碘化钾(KI)、六水合氯化钴(CoCl2·6H2O)、七水合氯化锰(MnCl2·7H2O)、五水合硫酸铜(CuSO4·5H2O)。

AHLs均购自Cayman Chemical公司，分别为C10-HSL(C14H25NO3，255.4 g/mol)、C12-HSL(C16H29NO3，283.4 g/mol)、C14-HSL(C18H33NO3，311.5 g/mol)，并于-20 ℃保存。

1.3 实验方法

通过PLC同时自动控制4组SBAR反应器，分别为R1、R2、R3、R4。其中R2不投加任何AHLs，作为空白对照组。而R1、R3、R4的投加方式如表 1所示，其中R1采用混合投加方式，R3、R4则是单一投加方式。实验采用的混合投加方式为在AGS培养的生长期(第1～25 d)、成熟期(第25～37 d)投加C14-HSL，在稳定期(第37～120 d)投加C12-HSL；R3采用的单一投加方式为只在生长期、成熟期投加C14-HSL；R4只在稳定期投加C12-HSL。实验AHLs均随进水进入反应器，其在进水终浓度为50 nmol/L[13]。

表1 AHLs投加方式

反应器运行条件如表2所示，为减轻污泥在接种期被大量排出反应器而降低生物量的情况，实验前期采用较长沉降时间(40 min)，随后逐渐减少至5 min(25 d内完成缩短)。4组反应器均运行120 d。

表2 实验运行条件

1.4 检测方法

激光粒度分布仪检测颗粒平均粒径，污泥质量浓度采用重量法[13]。EPS采用改良热提取法提取主要组分PS、PN，分别用硫酸-蒽酮法、考马斯亮蓝G-250法检测相对含量[14]。利用3D-EEM检测EPS中荧光组分，采用FTIR检测EPS中的官能团[15]。

2 结果与讨论

2.1 投加方式对AGS平均粒径的影响

颗粒的粒度分布能直观的反映出AGS整体的颗粒化程度。实验中定期(3～4 d)采样使用激光粒度分布仪测量AGS粒径信息。图2为平均粒径随运行时间的变化曲线。

图2 平均粒径的变化Fig. 2 Variations of average particle size

由图2可知，接种污泥的污泥粒径整体细小，平均粒径为0.06 mm。随着设备运行粒径的逐渐提高，在污泥接种后，R2、R3中平均粒径波动较小，分别在0.08～0.11 mm、0.10～0.12 mm区间。R1在第7 d时达到了前37 d里各反应器中的最大平均粒径(0.17 mm)，随后开始变小，在第13 d时与R2、R3相当(0.10～0.13 mm)，波动趋于稳定。R4则在第10 d后颗粒迅速增长，维持在0.14～0.16 mm。因此，C14-HSL这种信号分子对于AGS颗粒粒径的快速增长无明显的促进作用。R1、R3中颗粒在第29～36 d出现粒径增长现象，这说明 C14-HSL可能会作用于成熟期的AGS。第38～119 d是AGS稳定期以及解体初期的时段。在调整信号分子投加方式后，各反应器内的颗粒粒径出现明显的变化。R2中AGS在进入稳定期后，颗粒粒径逐渐增加，在第82 d时达到最大平均粒径(0.23 mm)，但在随后颗粒出现解体并伴随着污泥的大量流失，颗粒平均粒径明显减小(0.18 mm)。R3中AGS在进入稳定期后平均粒径波动显著(0.11～0.24 mm)。由此可知，停止C14-HSL信号分子的投加后，AGS的颗粒粒径稳定性会变差。R1中的平均粒径由第44 d的0.15 mm一直减少至第100 d的0.08 mm，并处于所有组中最低水平，这说明在更换信号分子投加后会导致颗粒出现粒径减小。R4的结果与之相类似，在第38～67 d颗粒粒径进一步变大，最大为0.24 mm；但在第67 d后，颗粒的平均粒径开始降低，到第85 d时已低于R1、R3，最终以0.15 mm的平均粒径至结束实验。

根据R2、R4的结果发现，生长期、成熟期未投加AHLs所形成的AGS在进入稳定期后，其颗粒粒径均出现先变大再减小的趋势。其中，R4比R2先出现减小趋势。尽管在第73 d时平均粒径已小于R2，但整体粒径趋于稳定。结合R3的结果可以发现，即使停止投加C14-HSL，反应器中的颗粒粒径变化仍能保持相对于R2、R4更稳定的状态。采用混合投加方式的R1的颗粒粒径状态最稳定。

2.2 投加方式对MLSS的影响

本实验的污泥是回流泵采样口的回流污泥，故接种污泥经过一定程度的浓缩(12 313 mg/L)。实验定期(3～4 d)采样检测ρ(MLSS)。在图3中第0～37 d，各组反应器接种完絮体污泥后均在50%的体积交换率下大量排泥。经过反应器对污泥的筛选作用，第13 d时各反应器污泥质量浓度得到恢复，R1、R2、R3、R4的ρ(MLSS)分别由4 999、5 580、5 624、4 216 mg/L升高至9 079、9 650、8 936、6 252 mg/L，随后各组在第23 d时污泥质量浓度开始降低，但降低的程度有明显差异。其中，R1、R3分别缓慢降低至5 738、6 595 mg/L，R2、R4在第26 d时已分别降至4 491、4 780 mg/L。由此，可以得出C14-HSL对污泥质量浓度的影响较明显，可以缓解成熟期AGS中颗粒污泥的流失，所以更多的中小型颗粒得以保留在反应器内，从而使颗粒平均粒径仍处于较低水平。在第38～119 d调整投加方式后，各组污泥质量浓度发生不同程度的变化。其中在第38～91 d，R1的波动性最小，其次是R2、R3，最差是R4(各组的方差分别为1.08×106、1.36×106、1.42×106、1.56×106)。尽管R4的污泥质量浓度稳定性差，但其具有最高的平均污泥质量浓度6 633 mg/L。当反应器继续运行至第119 d时，R2、R3出现大量污泥流失，分别降低到62、1 548 mg/L，而R1、R4在第112 d分别为4 338、4 301 mg/L。由此可知，C12-HSL信号分子对于维持AGS的污泥浓度稳定有明显作用。

图3 污泥质量浓度的变化Fig. 3 Variations of sludge concentration

分析认为，在各阶段投加AHLs都有利于污泥质量浓度提升。其中采用混合投加方式可以减少污泥质量浓度的波动，相比单一投加方式更能提高AGS稳定性。尽管R1颗粒平均粒径低于其他组，但R1较高的污泥质量浓度证明，反应器内中小型颗粒也具有优良的沉降性，从而不被排出。因此，R1更能抵御沉降时间对污泥量的影响。

2.3 投加方式对EPS相对质量分数的影响

AHLs会引起AGS中微生物对EPS分泌量的变化，因此定期(10 d)在4组反应器中取样进行EPS含量监测。按照EPS的不同分类方法，可根据EPS的结合类型、EPS组分两方面进行分析。

2.3.1 结合类型

图4是4组反应器中EPS相对质量分数的变化情形，按EPS的结合类型可分为松散型EPS(LB-EPS)、紧密型EPS(TB-EPS)两种主要类型[16-17]。对比LB-EPS与TB-EPS的相对质量分数可以发现，在絮体污泥、AGS中，TB-EPS占EPS总相对质量分数更高，同时总的EPS相对质量分数在培养过程中出现明显的波动，故TB-EPS的变化可能对AGS的稳定性有影响。在第0～30 d，各组EPS相对质量分数均出现随沉降时间减少而降低，在稳定沉淀时间后EPS相对质量分数逐渐升高。这是由于污泥的大量流失使得微生物处于快速增殖过程，而EPS的分泌相对减缓所导致。其中R2、R4中挥发性悬浮固体(VSS)总EPS相对质量分数比R1、R3高，R2、R4的平均总EPS质量分数分别为77.8、82.6 mg/g，R1、R3则分别只有73.5、63.6 mg/g。因此，C14-HSL不能明显促进EPS的分泌。R1、R3中的总EPS相对质量分数在第60 d时高于R2、R4(分别为85.7、82.8 mg/g)，但R1、R3中总EPS相对质量分数很快再次降低并在之后出现较多波动。这说明C14-HSL可以使AGS在培养初期形成稳定分泌EPS的基础。第80 d时R4开始出现总EPS相对质量分数增长，到第110 d时达到111.6 mg/g，仅次于R1的140.0 mg/g。R4整体的在经过较长时间投加C12-HSL后才能达到R1中总EPS相对质量分数水平，需要约20 d。

图4 EPS相对质量分数Fig. 4 EPS relative content

分析认为，C12-HSL比C14-HSL对TB-EPS的作用更显著，在稳定期里R1、R4具有更高的TB-EPS相对质量分数。然而C14-HSL对TB-EPS的影响体现在停止投加后的约30 d内，这样的延后性可能与在生长期、成熟期形成的种群结构有关。在C14-HSL调节形成的AGS能够应对污泥流失导致的EPS相对质量分数下降情况；而R1则是由于更换C12-HSL后，种群结构再次改变导致的EPS分泌量波动，同时R2的结果表明，在未投加任何AHLs情况下，污泥浓度的突然改变对EPS相对质量分数变化程度较小。但在混合投加方式下的R1，能够在更短的时间内恢复较高EPS相对质量分数，并保持至反应结束。利用两种AHLs的作用特点可以实现减缓污泥大量流失对EPS相对质量分数的影响程度，并使其快速恢复，从而使AGS具有更强的稳定性。

2.3.2 EPS组分

图5是各组EPS中PS的变化。在第0～10 d的4组反应器中发现PS较均匀分布于LB-EPS、TB-EPS中，而在第10 d后直至解体LB-EPS中的PS相对质量分数极低，维持在0～1.8 mg/g；位于TB-EPS中的PS相对质量分数整体变化不大。在第30 d的R2、R4中PS相对质量分数明显高于R1。尽管R1、R3的PS相对质量分数比接种污泥(34.2 mg/g)还低，但R1、R3中的PS主要以TB-EPS的形式结合在颗粒上。在第40～110 d期间，各组间PS相对质量分数差距较小，而R1、R4比R2、R3分泌量更稳定，R1、R2、R3、R4平均PS相对质量分数及方差分别为25.1、25.7、23.9、24.1 mg/g和37.7、91.2、71.7、41.9。这说明C12-HSL、C14-HSL对PS的分泌无明显促进作用。

图5 PS相对质量分数Fig. 5 PS relative content

各组EPS中PN的变化如图6所示。在第0～20 d期间R1、R2、R3、R4中的PN相对质量分数由接种污泥的36.7 mg/g降低至31.8、31.0、18.2、29.0 mg/g；在第20～30 d期间各组PN相对质量分数有不同程度的升高，其中R2最为显著，最高达到85.8 mg/g，其次是R1、R4分别达到72.9、78.4 mg/g，R3仅小幅增长至53.2 mg/g。这说明C14-HSL对PN相对质量分数的促进作用不显著，但R3中PN相对质量分数在第40 d时达到峰值78.1 mg/g后缓慢降低，再次说明C14-HSL可能影响AGS的种群结构。对比第40～110 d各组的PN相对质量分数变化可以发现，AGS在第30～40 d有25.0 mg/g左右的PN以LB-EPS形式结合在颗粒上，但随着AGS运行至稳定期这些PN逐渐减少，故在AGS中PN主要分布在TB-EPS中。另外，各组的PN相对质量分数在TB-EPS中差异较为明显，其中R1在第60 d时恢复到52.1 mg/g并在后续培养中波动升高；R2则是在第50 d时降至15.2 mg/g后PN相对质量分数开始缓慢增长；R3在第70 d时降低18.0 mg/g，随后PN相对质量分数快速增长；R4的PN相对质量分数增长速率和R2相当，在第80 d时开始出现明显波动，最终在第110 d时达到89.1 mg/g。

图6 PN相对质量分数Fig. 6 PN relative content

分析认为，PS相对质量分数在各组间差异较小，几乎不受投加方式的影响，而PN相对质量分数与AHLs的投加有明显相关性。通过在生长期、成熟期投加C14-HSL方式的R1、R3可以在AGS进入稳定期后，比未投加的R2、R4更能快速恢复PN相对质量分数。结合R1、R4的结果发现，只有在生长期、成熟期投加C14-HSL后，C12-HSL才可以加快PN相对质量分数恢复的速率，这说明C14-HSL调控形成的AGS对C12-HSL的响应更显著。因此，采用混合投加方式对AGS稳定性的调控更有效。

2.4 投加方式对EPS中荧光组分的影响

好氧颗粒污泥EPS的激发/发射(Ex/Em)荧光峰位置可以归纳如下：荧光峰 A(Ex：260～280 nm，Em：300～330 nm)，荧光峰B(Ex：270～295 nm，Em：260～290 nm)，荧光峰C(Ex：330～350 nm，Em：390～435 nm)，荧光峰D(Ex:250～280 nm，Em:380～455 nm)。其中，荧光峰A、B、C、D分别代表酪氨酸、色氨酸类蛋白质、腐殖酸、富里酸类物质[18-19]。

由图7可知，接种污泥EPS中有明显的荧光峰A和较低强度的荧光峰C；在第15 d时，各组荧光峰A仍具有极高强度，同时荧光峰B强度明显增加，荧光峰D小幅度增强，而荧光峰C仅在R2中有所增强。这说明4组反应器中酪氨酸类蛋白质、色氨酸类蛋白质随AGS的生长大量分泌，同时这些蛋白质的增加与2.1中颗粒粒径呈正相关关系。因此，酪氨酸类蛋白质、色氨酸类蛋白质会促进AGS的颗粒化。

图7 第0、15 d三维荧光光谱Fig. 7 3D-EEM spectra at 0 and 15 d

图8为第34 d三维荧光光谱。第34 d时，R2中荧光峰A、B、C强度降低，R4中荧光峰A、B的峰型有所减小，而R1、R3的荧光峰A、B的峰型由相对扁平的椭球形变大为卵形。这说明在成熟期的AGS中仍具有较高浓度的酪氨酸类蛋白质、色氨酸类蛋白质，C14-HSL有促进这些蛋白质分泌的作用。

图8 第34 d三维荧光光谱Fig. 8 3D-EEM spectra at 34 d

在第93 d时，R1、R4能一直维持高强度的荧光峰A、B，而R2中所有荧光峰消失，R3的荧光峰强度也出现降低，如图9所示。因此，C12-HSL会在AGS稳定期的中、后期促进LB-EPS里酪氨酸类蛋白质、色氨酸类蛋白质分泌，这与TB-EPS中PN在稳定期的相对质量分数结果相符合。分析认为，C12-HSL、C14-HSL两种AHLs都能促进TB-EPS中的酪氨酸类蛋白质、色氨酸类蛋白质的分泌，故在R3、R4的AHLs投加阶段可以检测到这些蛋白质较强的荧光峰，峰强度变化程度比R1大。混合投加方式可以稳定酪氨酸类蛋白质、色氨酸类蛋白质等EPS中关键组分质量分数。这些蛋白质能提升颗粒的疏水性，使粒径较小的颗粒仍能较快沉降而不被大量排出反应器，进而保证了反应器内污泥的浓度，有利于维持AGS的稳定。

图9 第93 d三维荧光光谱Fig. 9 3D-EEM spectra at 93 d

2.5 投加方式对EPS官能团的影响

利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)对EPS各组分官能团及蛋白质结构进一步分析。如图10所示，图10中R0为接种污泥，R1-1为第34 d时R1，R1-2为第114 d时R1，R2-1为第34 d时R2，R2-2为第114 d时R2，R3-1为第34 d时R3，R3-2为第114 d时R3，R4-1为第34 d时R4，R4-2为第114 d时R4。

图10 不同时期各反应器FTIR谱图Fig. 10 FTIR spectra of each reactor in different periods

C12-HSL、C14-HSL两种信号分子维持酪氨酸类蛋白质、天冬氨酸类蛋白质、蛋白质二级结构β-折叠的大量存在，保证了微生物的聚集性能，而且酪氨酸类蛋白质质量分数与3D-EEM图谱结果一致。多糖的变化和AHLs投加量无明显的相关性，但在絮体污泥变为AGS后，多糖的结构会发生变化，这有利于AGS的颗粒化，不受外源AHLs的调节。对比R1、R4的红外谱图发现，在稳定期投加C12-HSL能够使蛋白质二级结构β-折叠峰型变大，但R4不能达到R1中的相对质量分数水平，说明被C14-HSL调控后的AGS更能响应C12-HSL。这与2.3.2中的结果一致。R2、R3在进入稳定期后这些蛋白质特征峰明显减小且无明显差异，说明在停止C14-HSL投加一段时间后AGS会逐渐失去AHLs调控的优势。

3 结 论

(1)混合投加方式下形成的AGS平均颗粒粒径较小，仅有0.1 mm。这种方式可以减少颗粒粒径、污泥质量浓度的波动，从而提高了AGS的稳定性。

(2)AGS对AHLs的响应程度受投加方式影响。混合投加方式能使C12-HSL对AGS的调控更显著。C14-HSL调控培养的AGS能在稳定期C12-HSL的作用下形成比单一方式更高的TB-EPS相对质量分数，其中PN组分最显著。

(3)混合投加方式比单一方式能更快速恢复以及维持AGS中酪氨酸类蛋白质、色氨酸类蛋白质、天冬氨酸类蛋白质、蛋白质二级结构β-折叠的相对质量分数。这些蛋白与结构使得反应器中小粒径颗粒沉降性提高并大量保留，进而快速稳定颗粒粒径、污泥浓度波动，实现AGS长期稳定运行的调控。