变性梯度凝胶电泳法研究季节变化对散养芦花鸡肠道菌群的影响

张腾帅，张艳英，刘京国

（1农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206；2河北科技师范学院动物科技学院，河北 秦皇岛 066600；3河北省动物疫病预防控制中心，石家庄 050035）

0 引言

宿主和肠道微生物之间存在互利共生的关系，一方面，肠道微生物对宿主的营养、代谢、发育有促进作用，另一方面，肠道微生物也会为宿主带来各种致病菌[1-2]。鸡的肠道微生物还会影响鸡的产量[3-4]。鸡肠道微生物的组成受宿主因素，如品种、鸡龄、发育情况，和饲养管理，如饲养环境、饲料与饲料添加剂、健康干预等影响。有文献报道，1日龄的鸡肠道中已经有微生物存在[5-6]，但是，幼鸡肠道微生物组成变化很大[7-8]。因此，一般用至少20周龄的鸡来研究其肠道微生物组成。

高密度饲养鸡需要严格控制温度和湿度。即使这样，当外部气候条件发生改变时，如酷热天气，也会对鸡的健康和生产造成负面影响[9-10]。当环境温度较高时，可导致鸡小肠绒毛局部区域水肿、断裂，绒毛受到影响会严重减少。较典型的例子就是热应激可以降低家禽的肠道黏膜绒毛高度，而肠绒毛高度降低会导致表面积减少，从而影响肠道吸收与免疫功能，进而引发肠道内环境菌群平衡的失调[11]。持续偏热环境还可以降低盲肠细菌的总含量和肠道微生物的多样性，增加了致病菌的定植，从而降低了机体应对不良因素的能力[12]。对美国佐治亚州的商品肉鸡检测发现，鸡盲肠内微生物群落受季节变化影响较大。冬季盲肠内微生物的数量明显小于春季或夏季，而影响肠道健康的微生物在秋季明显减少[13]。类似的季节影响微生物群落的现象在青蛙中也存在[14]。

目前，中国对鸡肠道菌群的研究主要集中在日粮、抗生素、益生菌[15-16]等方面，季节环境条件对鸡肠道菌群影响还未见报道，更没有对提倡生态养殖的林下散养鸡肠道微生物影响的报道。盲肠因其独特的结构而具有丰富、多样和相对稳定的微生物菌群[17]，小肠是鸡肠道最主要的营养吸收部位，因此，本研究以林下散养芦花鸡的盲肠和小肠为研究对象，采用变性梯度凝胶电泳法分析季节对其肠道微生物群落的影响，以期能为散养鸡的养殖提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

芦花鸡（7—8月龄）由北京农学院实践基地散养。饲养过程中，未使用过抗生素等药物，食物主要为自给。在冬季（1月下旬左右）、春季（4个月下旬左右）和夏季（7月下旬左右），分别选取4只成年芦花鸡（公母各一半），采用喉咙放血的方法处死芦花鸡，打开腹腔，用线绳把盲肠和小肠中间段的两端结扎，在超净工作台内将同一季节的盲肠或小肠内容物分别取出、混匀后，分装于2 mL无菌离心管，-80℃保存。

1.2 肠道微生物16S rDNAV3区的扩增

采用CTAB法提取鸡肠道菌群基因组DNA。依据参考文献[18]，设计出16S rDNA V3区特异引物（表1）。以鸡肠道菌群基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系(50 μL)：10×缓冲液5 μL（含Mg2+），dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，引物(GC357F/517R;10 μM)1.0 μL，模板 DNA 1.0 μL，pfu DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，用ddH2O补足50 μL。PCR扩增条件如下：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。采用全式金公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit对PCR产物进行胶回收纯化。

表1 引物信息

1.3 变性梯度凝胶电泳及条带克隆测序

选用8%的聚丙烯酰胺凝胶进行DNA分离，以去离子甲酰胺与尿素作为变性剂，变性剂浓度梯度从上到下30% ～65%。凝胶先在1×TAE缓冲液下进行1 h预电泳，使电泳液加热至60℃。取10 μL PCR扩增片段上样，150 V电泳10 h。电泳完毕后用去离子水洗2次，硝酸银染色，Bio-Rad公司凝胶成像系统扫描照胶。

将凝胶上的共性条带与差异条带分别切下，用无菌水清洗后1 ～2次后放入1.5 mL离心管，加入50 μL 1×TE缓冲液，于暗处4℃过夜析出DNA。取2 μL析出液为模板，按上述方法再次扩增16S rDNAV3区，扩增产物纯化回收后，用DGGE电泳确定回收片段正确性。若正确，再取1 μL析出液为模板，以357F/517R为模板，按上述方法进行16S rDNA V3区扩增。扩增产物用EasyPure Quick Gel Extraction Kit进行胶回收纯化。纯化产物连接到pEASY-T1载体上。阳性克隆经PCR检验正确后，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.4 数据处理

DGGE凝胶染色后用Quantity One软件(Bio-Rad,USA)进行条带识别与灰度值分析。用UPGMA(unweighted pair group mean average)进行数据聚类分析。测序结果在NCBI的Blask中进行比对分析，样品的多样性用香浓指数(H)、均匀度(E)和丰富度(R)指标表示[12]。其中H和E的计算见公式(1)和公式(2)。

式中，pi为凝胶上单一条带的灰度值在该凝胶上所有条带总灰度值中所占的比率，N为DGGE图谱单一泳道上所有条带的丰度，Ni为第i条带的丰度；S是某样品中所有条带数目总和。

2 结果与分析

2.1 不同季节芦花鸡肠道菌群结构分析

从DGGE图谱（图1）中可以看出，盲肠、小肠菌群在不同季节的结构均存在差异。以冬季群落结构为100%，盲肠菌群的相似系数在春季、夏季时分别为82.3%、66.7%；小肠菌群的相似系数在春季、夏季时分别为77.8%、62.5%（表2）。这表明，盲肠和小肠的菌群结构都是在冬季和夏季时差异最大。季节对盲肠或小肠菌群的DGGE图谱条带数影响不大，但小肠菌群对应条带数比盲肠菌群明显较少，这说明小肠菌群的丰富度要明显低于盲肠。

图1 不同季节鸡盲肠(A)和小肠(B)菌群DGGE图谱

表2 鸡肠道菌群多样性指数

冬季、春季、夏季盲肠菌群的均匀度分别为0.95，0.94，0.96，整体变化不大；小肠菌群在冬季、春季、夏季的均匀度分别为0.89，0.80，0.89，相对盲肠而言整体较低，且春季时只有0.80。盲肠菌群在冬季、春季、夏季的香浓指数分别为3.02、3.49、3.19；小肠菌群在冬季、春季、夏季的香浓指数分别为2.82、2.07、2.49（表2）。这表明，随季节变化盲肠、小肠菌群的多样性呈现不同变化，其中盲肠菌群在春季时多样性最高，而小肠菌群在春季时多样性最低。

2.2 不同季节芦花鸡肠道共性菌群与特异菌群分析

从盲肠菌群DGGE图谱上共回收了11个条带，其中共性条带6条（图1A中编号1-3，6-8），特异性条带5条（图1A中编号4，5，9，10，11）。共性条带为盲肠内的主要优势菌种，主要为巨单胞菌属、拟杆菌属、梭菌属等（表3），它们的数量没有随季节改变而明显变化。特异性条带只在单一季节出现，其中冬季特异微生物为Paraclostridium benzoelyticum，夏季特异微生物为Colidextribacter massiliensis，而春季特异微生物为Lactobacillus johnsonii和L.amylovorus。

表3 DGGE图谱中条带的基因片段序列比对

从小肠菌群DGGE图谱上共分回收了8个条带，其中共性条带5条（图1B中编号a-e），特异性条带3条（图1B中编号f-h）。共性条带为小肠内的乳酸菌属和梭菌属（表3），它们的数量大都会随季节变化而变化。在3条特异性条带中，f为Uncultured bacterium，只存在冬季和春季小肠中；g和h为P.benzoelyticum，只存在夏季小肠中。

3 讨论

3.1 不依赖培养的微生物菌群分析方法比较

一直以来，人类采用传统的分离培养的方法研究肠道微生物。但是，这种方法具有高度的选择性，只能分离不到1%的可培养微生物[19-20]。随着分子生物学的发展，先后出现DNA指纹图谱技术，如变性梯度凝胶电泳(DGGE)和单链构象多态性(SSCP)，DNA芯片技术，高通量测序技术(HTS)。这些技术可以检测到那些不可培养的微生物[21-22]。其中DGGE和HTS技术在研究肠道微生物中应用比较广泛。DGGE的优势是可以用电泳图片直观地显示样本之间的差异，而且根据不同的目的设计不同的引物，还可以回收克隆目标条带。但是相对HTS技术而言，DGGE技术检测低丰度的微生物的能力较低[21-22]。夏围围等用实验证明，相对高通量测序结果，DGGE明显高估了土壤中大多数微生物类群的相对丰度，而低估了多样性指数的绝对值[23]。但是由于这两个技术各有优势，当前很多工作同时采用两种方法检测微生物群落变化[24-25]。

3.2 不同季节鸡肠道微生物菌群的比较

为更贴近现实地探讨了季节变化对鸡肠道菌群的影响，本实验选取的是林下散养成年芦花鸡（未使用过抗生素等药物，食物主要为自给），用DGGE的方法研究季节环境改变对鸡肠道菌群的影响。研究发现盲肠与小肠菌群随季节变化呈现截然相反的变化规律。盲肠菌群多样性春季时最高，夏季次之，冬季最低。这一变化规律与以前的报道类似。彭骞骞等[12]用DGGE方法证明，持续偏热环境可以降低盲肠微生物的多样性，26℃与31℃均降低了鸡盲肠菌群含量，减少了盲肠菌群多样性。Oakley等[13]用高通量测序方法研究也表明，冬季商品化肉鸡盲肠内微生物的数量明显小于春季或夏季。这可能是因为过冷或过热会导致家禽肠道黏膜结构发生改变所致[26]。但是，散养芦花鸡小肠内菌群的多样性在春季时最低，在冬季、夏季时会增高（表2）。这可能因为季节的变化会影响到鸡的代谢活动，从而进一步影响菌群在小肠内停留或定植的时间[13]。除了季节影响鸡肠道微生物的变化外，有文献报道，地域的不同也会造成鸡肠道微生物菌群的差异[27-28]。

本文在研究季节变化对鸡盲肠和小肠微生物菌群结构变化的基础上，进一步分析了不同季节的优势菌。结果表明，盲肠中的优势菌包括巨单胞菌属、拟杆菌属和梭菌属等。季节改变对盲肠共性菌株没有显著性影响，但对特异菌株有影响。冬季鸡盲肠中P.benzoelyticum会增多；夏季C.massiliensi（s一种产生的毒素能在宿主细胞上形成孔道的致病菌[29]）和E.coprostanoligenes会增多，而春季乳酸菌属会增多。小肠中的优势菌包括乳酸菌属和梭菌属。很多实验已表明，乳酸菌对鸡的生长、免疫系统和肠道微生物都有积极的影响[30-31]。而小肠内的优势梭菌属则是能分泌胆酸抑制致病菌的C.hiranonis[32]。与盲肠不同的是，季节改变既能影响小肠内共性菌株的相对比例（图1B中相同水平位置上带的亮度不同），又能影响特异菌株的含量，如夏季小肠内P.benzoelyticum和C.hiranonis会大量繁殖。这些结果对于利用肠道菌资源、开发新型微生态制剂，进而改善肠道菌群并提高生产性能，有着极其重要的理论意义和应用前景。

4 结论

本研究通过实验证明，季节对散养芦花鸡肠道菌群的多样性和结构有很大影响。盲肠菌群多样性春季时最高，夏季次之，冬季最低；而小肠肠道菌群正好相反。盲肠菌群要比小肠复杂。季节对盲肠和小肠中的优势共生菌影响不大，但鸡盲肠中冬季P.benzoelyticum会增多，夏季C.massiliensis和E.coprostanoligenes会增多，而春季乳酸菌属会增多。