辣木花粉离体萌发研究

普天磊，韩学琴，罗会英，邓红山，廖承飞，范建成，何 璐，金 杰

（云南省农业科学院热区生态农业研究所，元谋干热河谷植物园，云南 元谋 651300）

0 引言

辣木(Moringa oleiferaLam.)是辣木科辣木属的多年生落叶乔木，生长迅速，耐干旱贫瘠，环境适应性强，是热带亚热带地区的速生树种。辣木有13个种，原产于印度、肯尼亚、尼日利亚等国家，在中国云南、福建、广东、海南等地均有种植[1-2]。辣木含有丰富的矿物质、氨基酸、维生素、不饱和脂肪酸等营养成分和多糖、黄酮、酚酸、萜类等功能性成分[3-4]，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎等多种生理功能[5]，在食品、饲料和医药等行业应用广泛，享有“奇迹之树”的美誉[6]。辣木属于新兴的产业资源，相关育种及丰产栽培技术研究尚处于初级阶段，推进优质高产辣木品种的培育具有重要意义。

花粉活力的强弱是影响植物杂交育种、性状改良以及丰产栽培的重要因素之一，花粉活力的测定方法主要有I2-KI染色法、氯化三苯四氮唑法（TTC法）、醋酸洋红染色法、离体萌发法等，其中离体萌发法是目前评价花粉活力较为直观和准确的方法，在植物的育种研究中应用广泛[7-8]。目前关于花粉萌发条件优化的报道多集中于核桃、茶树、睡莲等植物，其中，核桃花粉离体培养基最佳组合为200 g/L蔗糖，500 mg/L硼酸，20 mg/L氯化钙[9]；茶树花粉离体萌发最佳培养基为150 g/L蔗糖，150 mg/L硼酸，100 mg/L硝酸钙[10]；睡莲花粉为100 g/L蔗糖，20或40 mg/L硼酸，20 mg/L氯化钙[11]；辣木花药细小，花粉黏在花药上不易分离观测，本研究采用的液体离体萌发法，有助于花粉分散，然而目前并没有辣木花粉离体萌发相关的报道。本文优化辣木花粉的离体培养基以及测定不同辣木材料的花粉活力，旨在为辣木杂交育种及丰产栽培研究中的育种亲本选择提供技术支撑，以促进辣木优良种质资源的开发和利用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验区概况 试验地点位于云南省楚雄自治州元谋县云南省农业科学院热区生态农业研究所辣木创新基地（25.69°N，101.87°E，海拔1118.1 m），株行距为2 m×2.5 m，该地属于季风型河谷干热气候，多年平均气温21.9℃，年降水量520 ～590 mm，年蒸发量4000 ～4300 mm，年日照时数2550 ～2744 h，具有“炎热干燥、降水集中、干湿季分明”的气候特征[12]。

1.1.2 材料 试验材料于天气晴朗的早晨9:00点时取样，选取长势良好、无病虫害的辣木植株，摘取盛开的辣木花朵带回实验室，小心用镊子拨开花瓣，分离出花药，用于花粉培养基筛选与不同材料的辣木花粉活力比较试验。

1.2 方法

1.2.1 花粉离体萌发法 取9粒新鲜采集的辣木花药置于EP小管中，使用移液器向管中加入300 μL培养液，将花粉轻轻剥落使花粉粒分散于培养液，并置于垫湿滤纸的培养皿中，避光条件下自然培养，定时观察，直至花粉萌发率稳定，观察前先将花粉培养基轻轻混匀，再使用移液器吸取适量滴在载玻片上，并用显微镜进行镜检，每个玻片随机选取5个不重复的视野，每个视野的花粉数不少于150粒，各处理重复3次，统计视野内的花粉总数和花粉萌发数，以每个处理的平均值代表相关结果，辣木花粉活力的计算见公式(1)：

1.2.2 培养基筛选 在前期预实验的基础上，以100 g/L蔗糖，100 mg/L硼酸，100 mg/L氯化钙作为基本培养基，探讨不同浓度蔗糖、硼酸、氯化钙对花粉萌发的影响。其中，蔗糖设定5个浓度梯度，分别为：50、100、150、200、250 g/L；硼酸设定的5个浓度梯度为：50、100、150、200、250 mg/L；氯化钙设定的5个浓度梯度为：100、200、300、400、500 mg/L。在单因素试验的基础上，以蔗糖(150、175、200 g/L)、硼酸(100、125、150 mg/L)、氯化钙(300、400、500 mg/L)进行4因素3水平共9个组合L9(43)的正交试验，每个组合进行3次重复试验，依据花粉萌发率筛选出辣木花粉的最佳萌发培养基。

1.2.3 不同辣木材料的花粉活力测定 选取长势良好，辣木籽产量大及不同种源的辣木材料，其中YMLM-2、6、8、9、10、25是楚雄综合试验站自选育的材料，YMLM-27、29、30分别是来自于肯尼亚、马里、美国的材料，对上述辣木材料的花粉活力进行测定，可为不同辣木材料的开花座果研究和杂交育种亲本选择研究奠定基础。

1.2.4 数据处理 采用Image-Pro Plus软件统计视野内的花粉总数和花粉萌发数，采用Excel软件进行数据统计，GraphPad Prism 6软件进行作图，SAS 9.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 辣木花粉萌发形态及过程

辣木花粉呈类球形，共有3个萌发孔，通常情况下每个辣木花粉粒仅一个花粉萌发孔萌发出花粉管，并形成4种不同时期的萌发状态。其中，辣木花粉萌发初期，花粉粒一侧隆起透明状凸起，随着萌发时间的延长，凸起部位逐渐增长，形成花粉管，花粉粒中的内含物会进入其中，均匀分布并逐渐充满于整个花粉管，形成萌发中期和后期的形态。此外，在同一处理的辣木花粉中，未萌发、萌发初期、萌发中期、萌发后期4种状态的辣木花粉粒均可同时存在（图1）。

图1 辣木花粉萌发图

2.2 不同培养基组分对辣木花粉萌发的影响

不同浓度的氯化钙处理中，辣木花粉萌发率较高的区域集中于300、400、500 mg/L三个浓度，其中当氯化钙浓度为400 mg/L时，花粉萌发率显著高于其他处理，值为4.61%。氯化钙浓度为200 mg/L时，花粉萌发率最低，为3.80%，且与300、500 mg/L浓度差异不显著。不同硼酸浓度处理呈现出中间高、两头低的分布趋势，50、200、250 mg/L三种硼酸处理浓度的花粉萌发率在3.45% ～3.60%之间，三者之值差异不显著，且它们的花粉萌发率显著低于100和150 mg/L两个处理，当硼酸浓度为150 mg/L时，辣木花粉萌发率最高，值为7.16%。当蔗糖浓度为150 g/L时，花粉萌发率显著高于其余处理，为7.85%；当蔗糖浓度达200 g/L以上时，辣木花粉萌发率逐渐降低，但无显著性差异；蔗糖浓度为100 g/L时，花粉萌发率最低，值为3.99%（图2）。

图2 辣木花粉离体萌发的单因素试验结果

2.3 正交试验处理对辣木花粉萌发的影响

单因素试验表明，辣木花粉在400 mg/L氯化钙，150 mg/L硼酸，150 g/L蔗糖的培养基中萌发表现较好，为了减弱这3个因素之间的交互作用，选取对花粉萌发影响较大的水平进行正交试验，确定萌发培养基的最佳浓度组合（表1）。试验发现3个因素对辣木花粉管萌发率的影响从大到小的排列顺序为：蔗糖质量浓度＞氯化钙质量浓度＞硼酸质量浓度。正交试验得出的最佳组合是A2B2C3，即氯化钙400 mg/L，蔗糖175 g/L，硼酸150 mg/L。对9组正交试验的花粉萌发率进行方差分析，结果表明第5处理的花粉萌发率显著高于其余处理，第2、6、9处理的花粉萌发率显著高于第1、3、7处理，且第2处理与第9处理间差异不显著，同时，第3处理与第7处理的花粉萌发率差异不显著，第1处理的花粉萌发率显著低于其余处理。对上述正交试验结果进行方差分析，详见表2。结果表明，氯化钙和蔗糖两个因素对辣木花粉萌发有显著性意义(P＜0.05)，而硼酸浓度对辣木花粉萌发无显著性意义。

表1 影响辣木花粉萌发的L9(43)正交试验结果

表2 花粉管离体萌发的正交试验方差分析

2.4 不同辣木材料的花粉活力

利用上面的配方对候选亲本材料的花粉萌发活力进行了测定，发现不同辣木材料间花粉萌发率间差别较大，其中YMLM-30的花粉萌发率最高，为12.34%，YMLM-27的花粉萌发率最低，为4.66%，YMLM-2、25、8的花粉萌发率显著高于YMLM-9、6、10、29、27，且YMLM-6、10、29的花粉萌发率差异不显著。不同种源的辣木中，美国种源的花粉萌发率最高(12.34%)，其次为马里种源，值为5.77%，最低为肯尼亚种源，花粉萌发率为4.66%。

图3 不同辣木材料的花粉萌发率测定结果

3 讨论与结论

前期预实验分别采用了I2-KI染色法、氯化三苯四氮唑法（TTC法）、离体固体培养基萌发法测定辣木的花粉活力，其中I2-KI染色法的测定原理是：有活力的花粉会积累淀粉，可被I2-KI溶液染成蓝色，发现试验用辣木花粉几乎未染成蓝色而呈黄色。TTC法是利用有活力的花粉呼吸作用强，产生的脱氢酶可将TTC由无色还原成红色的原理，从而可将花粉染成红色，试验发现TTC溶液不能将辣木花粉染成红色，仅使花粉颜色变浅，上述试验发现这两种染色法均不能很好的判断上述辣木材料的花粉活力有无。辣木花药细小，长度约为1 mm，且其花粉黏在花药上，干燥后不易分离，培养于固体培养基上的花粉粒相互粘连，不利于花粉总数统计，故本研究采用离体液体培养法对辣木的花粉活力进行测定。

本实验采用的花粉萌发培养基中，加入了蔗糖、氯化钙、硼酸3种基质，其中，蔗糖是花粉萌发的主要碳源，不仅可为花粉管细胞分裂和生化过程提供主要营养物质来源，而且还可用于维持渗透压[13-15]。高浓度的蔗糖培养基会造成黄牡丹花粉的原生质体萎缩，出现质壁分离的现象[16]，本研究单因素试验发现辣木花粉在150 g/L蔗糖浓度时无质壁分离的现象，且最有利于辣木花粉萌发。钙离子是花粉萌发和花粉管生长过程中所需的重要物质成分和信号分子[17]，适宜的钙离子浓度有助于辣木花粉萌发。Hofer等[18]发现，苹果花粉萌发孔附近的钙离子浓度最大，尚忠林等[19]也发现百合花粉管在生长过程中会吸收大量培养基中的钙离子，若减少钙离子含量，百合花粉萌发亦随之减少。本研究发现400 mg/L氯化钙浓度较利于辣木花粉萌发。硼离子会增加细胞内的游离钙离子，使其达到启动花粉萌发的最佳浓度[20]；同时还可参与花粉管壁的形成、花粉管囊泡运输、碳水化合物吸收以及酚类物质代谢等生理生化过程[21]，当硼酸浓度为150 mg/L时，较为适宜辣木花粉萌发。

不同辣木材料间的花粉萌发率差异显著，辣木花粉的萌发率不仅与品种有关，还与花粉的采集时间有关，相关学者也有类似的试验发现。孔德仓等[22]发现不同发育时期对枣花粉萌发率具有显著影响，且不同枣品种在不同发育期的花粉活力有显著差异。黄琼等[23]对4种散粉时期的薄壳山核桃花粉活力进行比较，发现散粉盛期的花粉活力最强。与此同时，改变培养温度、培养时间等参数，会使辣木花粉萌发率随之改变。杨澜等[24]探讨培养温度和培养时间对多肉植物花粉萌发的影响，发现12 ～28℃有利于提高花粉管萌发率。常海龙等[25]表明甘蔗花粉萌发率和花粉管发育对温度十分敏感，28 ～30℃花粉萌发率高且花粉管生长速度快。后续试验会继续对辣木花粉的最佳采集时间、培养温度、培养时间等参数进行探讨，另在进行不同材料或品种的花粉活力比较时，也需充分考虑上述参数对花粉萌发的影响，可对影响因素进行初步筛选并固定，再在同一条件下进行花粉活力比对。

本试验采用单因素和正交试验确立了辣木花粉萌发的最佳培养基，即175 g/L蔗糖，400 mg/L氯化钙，150 mg/L硼酸。并用该培养基测定了9种产量表现佳及不同种源的辣木材料，其中YMLM-30的花粉萌发率最高，为美国种源，YMLM-27的花粉萌发率最低，为肯尼亚种源。