山麻鸭OC-116基因克隆、生物信息学及组织表达谱分析

张迎燕，刘亚楠，郑定黔，田若宁，徐丽，李昂，吴旭

（福建农林大学动物科学学院（蜂学学院），福建福州 350002）

山麻鸭，也称龙岩麻鸭，饲养量高达2.5～3 亿只，是福建省数量最多、分布最广的中小型蛋鸭品种。它具有体型小、早熟、产蛋量高、适应性强及饲料转化率高等显著特征。在我国禽蛋产业中，鸭蛋产量约占禽蛋总量的12%，具有重要的经济价值。

蛋壳特异性基质蛋白是禽类蛋壳中主要的组成成分，其分布在蛋壳的各个区域，并伴随不同阶段蛋壳的矿化过程，发挥着不同的作用和功能。OC-116 蛋白是第一个被克隆的蛋壳特异性基质蛋白。该蛋白质主要以含有GAG（Glycosa Minoglycan）和不含GAG 的形式存在于禽类的蛋壳中。这2 种形式主要通过蛋白质翻译、糖基化转化和寡糖基化修饰，从而形成蛋白聚糖，进而使该糖蛋白携带糖胺聚糖。糖胺聚糖因含有丰富阴离子，对Ca具有较强的结合亲和力，这一特征有助于形成CaCO结晶体，而CaCO结晶体是禽类蛋壳重要的组成成分，因此，OC-116 蛋白聚糖对禽类蛋壳具有重要影响。基因编码的氨基酸序列中载有2个N 糖基化位点和2个二硫化物结合物，在蛋壳钙化的过程中起主要作用。Dunn 等以2 000 只母鸡为材料，对传统蛋壳性状指标进行测定，并与基因进行了关联分析，显示该基因与蛋壳性状指标有明显的相关性。

本研究以山麻鸭作为实验动物，从其子宫部组织中克隆基因，并进行了序列、理化性质、结构分析与预测、物种间同源性分析及不同组织中的表达谱分析，为进一步探究山麻鸭基因与蛋壳形成的相关性提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验样品 于福建省龙岩市山麻鸭原种场随机选取处于产蛋高峰期（30 周龄）的山麻鸭9 只，每3 只鸭子的同一组织混为一个样品，共做3个重复。用手术刀和镊子取心、肝、脾、肺、肾、胸肌、肌胃、下丘脑、垂体、卵巢、漏斗部、膨大部、峡部、子宫部组织，无菌生理盐水冲洗后放入2 mL 的冻存管中，做好标记，迅速置于液氮中保存，随后转移至-80℃冰箱中保存。

1.2 引物设计与合成 根据绿头鸭（Anas platyrhynchos）的基因（登录号：XM_027456976）序列，设计基因的同源扩增引物，PCR 扩增并测序。设计3'RACE及5'RACE 扩增引物，做3'RACE 及5'RACE 实验，获得基因的3'末端及5'末端序列。设计的引物信息如表1 所示，引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

表1 山麻鸭OC-116基因所有引物序列

1.3 组织RNA 提取与cDNA 合成 使用TaKaRa RNAwaso plus 试剂盒提取14个山麻鸭组织RNA，并检测其总RNA 的浓度、纯度以及完整性，-80℃保存。以山麻鸭的子宫部组织RNA 为模板，使用PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa,Code No.6110A）试剂盒逆转录合成cDNA，使用Tks Gflex ™ DNA Polymerase（TaKaRa,Code No.R060A）试剂盒对基因进行PCR 扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，切胶回收并测序。

1.4基因全长cDNA 的克隆 3' RACE 和5'RACE扩增实验：3'RACE PCR 反应，根据同源扩增获得的序列，设计合成3'RACE 引物，以子宫部获得的cDNA 作为模板，使用上述引物，做2 次3'RACE PCR 扩增，分别切胶回收目的产物，对回收的PCR产物直接测序，均使用各自GSP 引物测序。5'RACE PCR 反应，根据已获得序列，设计合成5'RACE PCR 引物。使用SMARTerRACE 5'/3'Kit（TaKaRa,Code No.634858）进行反转录合成cDNA，以获得的cDNA 作为模板，做5'RACE PCR 扩增，以上述实验中GSP1 引物扩增获得的产物作为模板，用各5'RACE-GSP2 引物分别与Short 引物做5'RACE 套式PCR 扩增。切胶回收上述产物目的条带，Infusion 克隆到pRACE 载体，挑选阳性克隆菌液，提取质粒送往北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。

序列线性关系扩增验证：在RACE 实验获得的序列上，设计扩增引物，对3'RACE 及5'RACE 获得的序列做线性关系验证确认。

1.5基因的生物信息学分析 将山麻鸭基因的测序结果用DNAStar 软件进行拼接，并与GenBank 登录的基因序列进行BLAST分析。利用ExPASy 数据库的ProtParam（http://expasy.org/tools/proparam.html）软件分析氨基酸序列；利用SignalP4.1在线软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行信号肽预测分析；通过TMHMM 在线工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对编码氨基酸的跨膜结构区域进行预测；利用PredictProtein在线工具（http://www.predictprotein.org/）对蛋白质二级结构进行预测；利用MEGA-6.0 软件，根据编码的氨基酸序列信息，以N-J 算法，Bootstrap 设为1 000，对基因绘制系统进化树，并进行遗传进化分析。

1.6基因组织表达分析 实验以山麻鸭14个组织样品的cDNA 为模板，基因为内参基因，进行实时荧光定量PCR 检测，对14个组织样品中基因的相对表达量进行分析。

1.7 统计分析 本研究所采用的定量法为相对定量法，参照2计算公式计算出基因在不同组织中的差异表达，并使用SPSS 22.0 软件进行方差显著性检验，以<0.05 表示差异显著，<0.01 表示差异极显著作为判断标准，并用GraphPad Prism 7.00 绘制图表。

2 结果与分析

2.1基因全长cDNA 序列的获得 通过DNAstar软件分析可知，基因的cDNA全长为2 129 bp，其中3'端序列长度为171 bp，5'端序列长度为50 bp，开放阅读框的长度为1 908 bp，编码635个氨基酸（图1），其GeneBank 登录号为：MW541048。

图1 OC-116基因的全长cDNA 序列及氨基酸组成

2.2基因编码氨基酸的理化性质分析 结果表明，该基因预测的分子式为CHNOS，相对分子量为64 247.16。理论等电点（pI）为6.01，其有74个带负电的残基（Asp+Glu），62个带正电的残基（Arg+Lys）。对其进行不稳定性预测，发现该蛋白是不稳定性系数为73.58 的不稳定蛋白。脂溶系数为58.76，总的平均亲水系数为-0.565，其疏水值在第7个氨基酸处最大，在第70个氨基酸处最小，疏水值分别为3.067 和-2.700（图2-A）。基因编码的635 种氨基酸中，甘氨酸（16.5%）、丙氨酸（11%）、丝氨酸（10.2%）含量较高。

用Signal P4.1 在线软件进行信号肽预测分析，结果由图2-B 可知：该基因的预期剪切位点在16 至17个氨基酸之间。使用TMHMM 在线软件预测跨膜结构，可以看到该蛋白质不包含跨膜结构（图2-C）。通过PredictProtein 软件对山麻鸭OC-116 蛋白二级结构预测分析可知，螺旋（Hh）、折叠（Ee）、和无规卷曲（Cc）分别占比0.47%、17.64%和81.89%。

图2 OC-116 蛋白的理化性质和蛋白结构图

2.3 山麻鸭基因同源性分析及系统进化树构建结果表明，基因与绿头鸭和黑天鹅的核苷酸序列同源比对结果分别为100%和93.37%。与绿头鸭、黑天鹅和棕硬尾鸭的氨基酸序列同源性分别为99.54%、89.78%和87.75%。根据编码的氨基酸序列信息，使用MEGA 6.0 软件构建了12个生物的系统进化树（图3）。从图中可以看出：与黑天鹅（XP_035410799.1）、绿头鸭（EOB06364.1）和棕硬尾鸭（XP_035180566.1）的亲缘关系最近，与原鸽（PKK28944.1）、原鸡（NP_9 89900.1）、鹦鹉（KQK84288.1）、企鹅（XP_019327876.1）和杜鹃（XP_009557835.1）的亲缘关系次之，与家燕（RMC13647.1）、鳄鱼（XP_019382161.1）和乌龟（XP_039397699.1）的亲缘关系最远。

图3 OC-116基因的系统进化树

2.4 山麻鸭基因不同组织中的相对表达量分析应用qRT-PCR 方法对山麻鸭基因14个组织样品的相对表达量进行分析（以卵巢为对照组），结果见图4。结果显示：mRNA 在子宫、峡部和垂体中的表达量极显著高于其他组织。在肺、膨大部和漏斗部中的表达也相对较高；但在卵巢，肾脏和心脏中，以及胸肌中的表达水平相对较低；下丘脑、脾脏、肝脏和肌胃组织中的表达水平达到最低。

图4 OC-116基因在山麻鸭不同组织中的mRNA 相对表达量

3 讨 论

OC-116 蛋白是蛋壳基质蛋白中的一员，是一种与生物钙化紧密关联的蛋白质。本实验通过RACE 克隆技术获得了山麻鸭基因的cDNA全长序列，其长度为2 129 bp，开放阅读框为1 908 bp，可编码635个氨基酸，并对该基因编码氨基酸的理化性质进行分析，所得结果与该基因在其他禽类蛋壳中的研究结果相类似。说明基因在禽类中的进化过程中具有较高的保守性。对基因在NCBI 上进行Blastn 和Blastp多重比对发现，山麻鸭与黑天鹅、绿头鸭和棕硬尾鸭的亲缘关系最近，与家燕、鳄鱼和乌龟的亲缘关系最远。有研究表明，OC-116 蛋白在蛋壳钙化层及表面有机层中均有分布，与蛋品质的蛋形指数、蛋壳厚度及蛋壳强度密切相关。Mourik 等发现OC-116 蛋白是鸡蛋壳基质的主要成分，首先在蛋壳中鉴定到，参与蛋壳钙化，对蛋壳品质有重要的影响。Ahmed 等发现在强制换羽后老龄化母鸡身上，OC-116 蛋白的含量会随着蛋壳强度的增加而增加，推测OC-116 蛋白含量与蛋壳强度大小呈正相关。以上研究均表明OC-116 蛋白与禽类蛋品质密切相关。虽然OC-116 蛋白在其他物种中已有研究，但在山麻鸭中是首次，对基因的克隆为进一步研究鸭蛋蛋品质提供了丰富的生物信息学材料。

本实验应用qRT-PCR 方法对基因在山麻鸭体内14个组织中的相对表达量进行分析。结果显示：该基因在子宫部、峡部和垂体中的表达量极显著高于其他组织。在前人研究中已被证实这2个部位分别是蛋壳钙化和蛋壳膜形成的重要部位，推测本研究中的基因在蛋壳形成过程中也发挥着类似的作用。叶幼荣对蛋鸡不同产蛋期生殖器官中mRNA的相对定量进行研究，得到该基因在子宫部和峡部上的表达量最高，这一结果与本实验结果相类似。Miksík等研究发现OC-116 蛋白是一种糖蛋白，它存在于蛋壳的多个部位，在蛋壳的乳头层、角质层、栅栏层中均能检测到该蛋白的存在。表明该蛋白在蛋壳的形成过程中，主要通过钙沉积的方式，来影响蛋壳表面的结晶体矿物质，进而对蛋壳质量产生影响。OC-116 蛋白是一种有利于蛋壳钙化的蛋白多糖，它通过促进Ca的结合和沉淀从而有助于蛋壳的生物矿化过程。杨凌霄等发现基因主要作用于蛋壳表面的碳酸钙和方结晶体，进而对蛋壳不同形成阶段进行调控，从而影响蛋壳质量。吴磊等以长顺绿壳蛋鸡为实验材料对基因与蛋鸡的蛋品质性状指标间进行了核苷酸多态位点关联性分析，发现AA 基因型和CC 基因型均是改善蛋壳品质的有利基因型，而双倍型H2H2 是改善蛋壳品质的有利双倍型。以上研究均表明，基因在蛋壳的钙化、矿化及蛋壳的形成过程中发挥着重要的作用，推测基因在山麻鸭蛋壳形成过程中也发挥着类似的作用。

4 结 论

本实验首次克隆了山麻鸭基因的全长cDNA 序列，并做了组织表达谱。该基因在山麻鸭不同组织中均有表达，在子宫部和峡部中的表达量极显著高于其他组织；其中子宫部和峡部分别是蛋壳矿化和蛋壳膜形成的部位，表明该基因在山麻鸭蛋壳的形成过程中扮演着重要角色，为以后研究提供了研究素材。