β-胡萝卜素对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎的缓解作用

宋 阳，朱凌羽，黄云鹤，吕军田，郑鑫*

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118；2.永吉县畜牧兽医工作总站，吉林吉林 132200；3.长春市九台区畜牧总站，吉林长春 130519）

炎症性肠病是一种慢性、复发性的肠道炎症疾病，主要分为克罗恩病和溃疡性结肠炎2 种类型，临床表现为严重的腹泻、疼痛、血便和体重减轻。通过饮用水来向啮齿动物施用葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium，DSS），建立溃疡性结肠炎模型是使用最广泛、快捷的方法，具有可重复性和可控性，DSS 会导致肠道通透性改变，炎性细胞引入。近年来，我国炎症性肠病的发病率逐年增加，已成为世界范围内的卫生保健问题，但炎症性肠病的发病机制至今尚未阐明。目前用于治疗炎症性肠病的药物对胃肠道和肝脏具有一些不良的副作用和并发症，所以寻找一种低毒性、具有抗炎作用的天然药物是解决问题的有效途径。

-胡萝卜素是类胡萝卜素之一，在自然界中普遍存在。许多试验研究表明，-胡萝卜素具有抗氧化、清除自由基、增强免疫力、预防癌症等功能，因此被广泛用于食品、饮料、化妆品等行业。在现代畜牧行业，免疫营养已经成为一种新概念，人们更加注重寻找安全、有效的天然药物替代抗生素来保证动物的健康成长及生活质量。本试验用DSS 建立小鼠溃疡性结肠炎模型，探究-胡萝卜素对溃疡性结肠炎的缓解作用，为溃疡性结肠炎的防治及-胡萝卜素作为功能性饲料添加剂的推广提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂 DSS（MW:3600～5000，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），-胡萝卜素（纯度≥97%，美国Sigma 公司），RNA Lyzol、cDNA 逆转录试剂盒（日本TaKaRa 公司），BCA 法蛋白定量试剂盒、RIPA 裂解液（上海碧云天生物技术有限公司），ELISA 试剂盒（江苏酶免实业有限公司），引物（上海生工生物工程股份有限公司），NF-B p65 抗体、p-NF-B p65 抗体、-actin 抗体、HRP 标记的山羊抗兔抗体及山羊抗鼠（美国Cell Signaling Technology），便隐血试剂盒（珠海贝索生物技术有限公司）。

1.1.2 仪器 Thermo 酶标仪（上海赛默飞世尔科技有限公司），高速冷冻离心机（德国Sigma 公司），荧光定量PCR 仪、凝胶成像仪（美国Bio-Rad 公司），切片机（德国Leica 公司）。

1.2 试验设计

1.2.1 试验动物及分组 选取40 只6～7 周龄、体重（26±2）g 的昆明雄性小鼠（辽宁长生生物技术股份有限公司）。将昆明小鼠随机分为对照组、-胡萝卜素组、DSS 组及-胡萝卜素+DSS 组，每组10 只。将所有小鼠饲养在12 h 明暗交替循环、温度（25±1）℃的无菌动物实验室内，饲养期间饲喂标准小鼠日粮，保证小鼠自由饮水与采食，适应3 d 后进行后续试验，在试验前禁食12 h。

1.2.2 试验模型的建立 将DSS 溶于蒸馏水中，制成浓度为3%（w/v）的DSS 溶液，-胡萝卜素溶于橄榄油中。对照组及-胡萝卜素组的小鼠自由饮水，而DSS 组和-胡萝卜素+DSS 组小鼠自由饮用3%DSS 溶液；对-胡萝卜素组与-胡萝卜素+DSS 组小鼠灌胃100 mg/kg-胡萝卜素，同时对照组与DSS 组进行同等条件灌胃0.1 mL/10 g 的橄榄油。试验期为7 d，期间每天对小鼠进行称重，在7 d 后处死小鼠，取结肠、血液。用生理盐水清理取出的结肠，结肠前段用于qPCR 技术的测定，后段用于Western blot 的检测，吸净水分后放入液氮中冻存，中间部分结肠肠段在4% 多聚甲醛溶液中固定待用。

1.3 表观指标的观测 监测小鼠每天的体重变化，观察精神和皮毛状态，通过便隐血试剂盒检测便血情况。根据表1 的评分标准进行疾病活动指数（Disease Activity Index，DAI）评分，试验前记录小鼠的结肠长度。

表1 DAI 评分标准

1.4 结肠组织病理观察 将各组固定在4%多聚甲醛溶液中的小鼠结肠组织经过不同浓度梯度的乙醇脱水、二甲苯透明后进行石蜡包埋、切片；将切片进行常规脱蜡复水、苏木精-伊红染色、不同浓度的乙醇冲洗、二甲苯透明后，用中性树胶封片进行光镜观察。

1.5 ELISA 法检测炎症指标 小鼠采用眼球采血，血液收集到1.5 mL 的离心管中，4℃静置30 min 后放入冷冻离心机中，3 500 r/min 离心15 min，分离血清。参照ELISA 试剂盒说明书检测血清中肿瘤坏死因子-（Tumour Necrosis Factor-，TNF-）、白细胞介素6（Interleukin-6，IL-6）、细胞因子白介素1（Interleu kin-1，IL-1）含量。

1.6 荧光定量PCR 检测相关炎症指标的mRNA 表达取出冻存的结肠组织，根据RNA Lyzol 说明书提取组织中的RNA，并对样品进行RNA 质量的检测，使D/D及D/D保持1.8～2.0，随后按照cDNA 逆转录试剂盒的步骤将提取的RNA 反转录为cDNA，最后采用荧光定量PCR 技术进行表达量的测定。20 µL 反应体系：SYBR 10 µL，上、下引物（10 µmol/L）各1 µL，cDNA 模板2 µL，ddHO 6 µL，采用95℃预变性30 s；95℃变性5 s、60℃退火30 s、39个循环；65℃ 5 s、95℃ 5 s 的扩增程序。每次试验将18S RNA 设置为内参，用2法计算结肠组织中的mRNA 相对表达量，引物序列如表2 所示。

表2 引物序列

1.7 Westorn Blot法检测小鼠结肠中NF-B p65 及p-NF-B p65 的蛋白表达 取出冻存的结肠组织，并在冰上进行以下操作：用预冷的PBS 洗涤1～2 次，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液进行组织匀浆后放入4℃高速离心机中，12 000 r/min 离心5 min，提取上清，采用BCA 法进行蛋白浓度的测定。取60 µg 总蛋白进行SDS-PAGE 凝胶电泳，将蛋白转印至PVDF 膜上，用5% 的脱脂奶粉封闭1 h，选取兔源的NF-B p65 抗体（1:1 000）、兔源的p-NF-B p65 抗体（1:1000）及鼠源的-actin 抗体（1:5 000）作为一抗，4℃过夜孵育。用TBST 溶液洗膜后加入二抗：HRP 标记的山羊抗鼠（1:2 000），山羊抗兔（1:2 000），37℃孵育1 h，TBST 洗膜，进行凝胶成像，蛋白表达量通过灰度分析的比值来表示。

1.8 统计分析 数据用平均值± 标准误表示，采用单因素方差分析，使用SPSS 23.0 软件对各处理组采用Duncan's 法进行多重比较分析，<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1-胡萝卜素对DAI 评分、小鼠日增重变化及结肠长度的影响 如图1 所示，与对照组相比，DSS 组小鼠在试验的第3 天体重下降（<0.05），DAI 分数在第4 天呈相反趋势（<0.05），结肠长度缩短（<0.05），-胡萝卜素组小鼠的体重变化、DAI 以及结肠长度无显著差异（>0.05）；而相较于DSS 组，-胡萝卜素+DSS组小鼠的体重、DAI 分数下降、结肠变长（<0.05）。综合所述，小鼠溃疡性结肠炎模型建立成功，-胡萝卜素对小鼠无毒害作用并且对溃疡性结肠炎具有缓解作用。

图1 β-胡萝卜素对DAI 评分、小鼠日增重变化及结肠长度的影响

2.2-胡萝卜素对小鼠结肠组织的病理学影响 如图2所示，DSS 组中结肠的隐窝结构异常，出现隐窝分支、扭曲、萎缩，杯状细胞减少，伴有炎性浸润；而-胡萝卜素+DSS 组的结肠隐窝结构异常变化较小，炎性浸润较少；对照组及-胡萝卜素组结肠的隐窝结构正常。试验结果表明，DSS 成功诱导了小鼠溃疡性结肠炎，并且-胡萝卜素能缓解溃疡性结肠炎小鼠的结肠损伤。

图2 各组小鼠结肠组织HE 染色

2.3-胡萝卜素对溃疡性结肠炎小鼠血清中相关炎症指标的影响 如表3 所示，与对照组相比，DSS 组中TNF-、IL-6、IL-1含量升高（<0.05）；与DSS 组相比，-胡萝卜素+DSS 组中TNF-、IL-1、IL-6 含量降低，其中IL-6 含量存在显著差异。结果表明，-胡萝卜素能降低炎性因子含量，减轻小鼠的结肠炎症。

表3 β-胡萝卜素对溃疡性结肠炎小鼠血清中炎性因子含量的影响

2.4-胡萝卜素对溃疡性结肠炎小鼠结肠中炎性因子mRNA 相对表达量的影响 如图3 所示，与对照组相比，DSS组小鼠结肠中mRNA 相对表达量升高（<0.05）；与DSS 组相比，-胡萝卜素+DSS 组小鼠结肠的mRNA 相对表达量降低（<0.05）。结果表明，DSS可以诱导炎症因子的基因表达，从而引发结肠炎症，而-胡萝卜素可以抑制的基因转录水平，缓解溃疡性结肠炎。

图3 β-胡萝卜素对溃疡性结肠炎小鼠炎性因子mRNA 相对表达量的影响

2.5-胡萝卜素对小鼠结肠中NF-B 蛋白表达的影响如图4 所示，DSS 组中小鼠结肠NF-B p65 的蛋白相对表达量高于对照组和-胡萝卜素+DSS 组（<0.05），DSS 组中p-NF-B p65 的蛋白相对表达量高于对照组（<0.05）。结果表明，-胡萝卜素可以通过抑制NFB p65 蛋白的活化来缓解DSS 诱导的溃疡性结肠炎。

图4 β-胡萝卜素对小鼠结肠中NF-κB 蛋白表达的影响

3 讨 论

溃疡性结肠炎在不同程度上可引起从直肠到近端结肠的连续黏膜炎症，具有反复发作的特点，其经典组织学变化包括隐窝密度降低，隐窝结构变形，不规则的黏膜表面和严重的弥漫性黏膜炎症。本试验结果表明，-胡萝卜素的干预可以抑制结肠长度缩短，改善结肠组织中的隐窝异常结构和炎性浸润水平，能够有效缓解造模小鼠的体重降低及便血腹泻等现象。

炎症是宿主对感染和组织损伤的一种保护性反应，可作为预防病原体扩散，促进病原体破坏和伤口愈合的机制。尽管炎症通常能及时得到解决，并且对宿主有益，但炎症失调是多种慢性炎症疾病的发病机制。溃疡性结肠炎模型导致的组织学严重损害与高水平促炎细胞因子的产生密切相关。TNF-是TNF 超家族的原型成员，主要由巨噬细胞和单核细胞分泌，是炎症反应和相关疾病的产生和发展中的主要促炎细胞因子，在产生炎症反应中具有多种作用，如刺激促炎因子（IL-1、IL-6、IL-8、NF-B）和黏附因子的产生。IL-6 是一种具有184个氨基酸的四螺旋多效细胞因子，该蛋白质由成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞、T 细胞和内皮细胞合成，其合成和分泌在炎症条件下诱导，在免疫反应、炎症和造血中起着重要作用。IL-1是抗微生物免疫以及自身免疫炎症的关键介质、有效的促炎因子，对于宿主反应和对病原体的抵抗至关重要，还会加剧慢性疾病和急性组织损伤期间的损害。这些细胞因子在肠道的免疫系统中起着重要作用，它们是免疫系统中的关键信号因子。本试验结果表明，与对照组相比，DSS 组小鼠血清及组织中TNF-、IL-1、IL-6 的表达水平显著升高；与DSS 组相比，-胡萝卜素的添加能显著抑制IL-6 的表达水平及结肠组织中TNF-的表达，说明-胡萝卜素能有效抑制溃疡性结肠炎小鼠TNF-、IL-1、IL-6 的表达水平。

长期以来，由于NF-B 在促炎因子基因（包括细胞因子、趋化因子和黏附分子）表达中的作用，核因子NF-B 途径一直被认为是典型的促炎信号传导途径，激活的NF-B p65 过度增加是许多慢性疾病（如类风湿关节炎、炎性肠病、多发性硬化症，甚至神经退行性病变）的发病机理不可或缺的，因此，NF-B p65 信号通路已成为药物开发和研发的关键点。本试验结果表 明，DSS 组小鼠的NF-B p65 及p-NF-B p65的蛋白表达较对照组显著升高，而-胡萝卜素的干预抑制了NF-B p65 活化，与结肠组织中NF-B mRNA 表达相同，说明-胡萝卜素能抑制炎症因子的表达。

综上所述，-胡萝卜素能有效缓解DSS 诱导的小鼠溃疡性结肠炎，可能是通过抑制NF-B 的表达及活化，进而抑制促炎因子TNF-、IL-1、IL-6 的释放。由此推断，-胡萝卜素缓解小鼠的溃疡性结肠炎可能与NF-B 这条重要的信号通路有关，-胡萝卜素作为一种天然的功能性饲料添加剂可能为预防和治疗溃疡性结肠炎开辟了一条新途径。