卓泽文,刘树荣,李名志,王 宇,2,孔令保,2
(1.南昌市动物病毒与基因工程重点实验室,南昌 330045;2.江西农业大学生物科学与工程学院,南昌 330045)
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的家猪、野猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病,所有品种和年龄的猪均可感染,发病率和死亡率最高可达100%,且目前全世界没有有效的疫苗[1]。自2018 年8 月在沈阳发现中国首例非洲猪瘟病例以来[2],中国大陆32 个省级行政区均已发生非洲猪瘟疫情[3],对中国养猪业及其相关产业发展产生了巨大威胁,直接经济损失高达数百亿元。农业农村部发布的《非洲猪瘟疫情应急实施方案(2020 年第二版)》建议从生猪的生产养殖、调运、屠宰等环节建立检测监测,故ASFV 的现场、快速、灵敏、准确检测是及时发现和控制非洲猪瘟疫情的关键。
ASFV 是一种大型的高度复杂的包膜双链闭合线性DNA 病毒[4],p72编码基因位于遗传多样性极低的区域,是ASFV 株系分型的重要基因,因此是核酸检测的最佳靶基因之一[5,6]。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术自2000 年日本学者Notomi 等在《Nucleic Acids Research》上报道后,经过20 多年的发展,已经成为一项十分成熟的技术[7]。目前针对ASFV 的检测方法主要是核酸检测和抗体检测。在中国动物疫病预防控制中心OIE 参考实验室公布的非洲猪瘟现场快速检测试剂评价工作中,抗体检测试剂的敏感性只有60%~70%,而核酸检测试剂的敏感性达93%~100%。此外,抗体检测成本较高、再现性较差、操作复杂,很难在基层实验室和猪场推广使用;荧光定量PCR 等方法仍存在对检测设备有较高要求、用时较长等问题,不能满足于现场和基层实验室的快速检测。本研究基于LAMP 技术建立一种适合猪场和农户现场检测的高效、简便、准确、价格低廉的ASFV快速检测方法。
Bst 3.0 DNA 聚合酶及其缓冲液购自NEB 公司;甜菜碱购自Solarbio 公司;核酸电泳10×Loading buffer购自TaKaRa 公司;2k DNA Marker、核酸染料购自北京全式金生物技术有限公司;10 mmol/L dNTP 购自生工生物工程(上海)股份有限公司;琼脂糖购自GenStar公司。
梯度PCR 仪购自美国Bio-Rad 公司;凝胶成像分析系统购自上海勤翔科学仪器有限公司;琼脂糖水平电泳仪购自上海天能科技有限公司;掌上离心机购自大龙兴创实验仪器(北京)股份公司。
模板为本实验室保藏的pCMV-ASFV-p72 质粒,将该质粒序列信息在NCBI 官网上进行BLAST比对,确定保守序列。将ASFVp72基因保守序列导入LAMP 引物在线设计软件Primer Explorer V5,设计并筛选出一组LAMP 引物,引物序列信息见表1。引物扩增核心区域167 bp,引物由北京擎科生物科技有限公司(长沙)合成。
表1 LAMP 引物序列信息
Bst 3.0 DNA 聚合酶使用说明书推荐的LAMP 反应体系各成分终浓度为1×等温扩增缓冲液Ⅱ(含2 mmol/L MgSO4)、6 mmol/L MgSO4、1.4 mmol/L dNTPs、1.6 μmol/L FIP、1.6 μmol/L BIP、0.2 μmol/L F3、0.2 μmol/L B3、320 U/mL Bst 3.0 DNA 聚合酶、模板、ddH2O。以该体系为基础,以pCMV-ASFV-p72质粒为模板,ddH2O 为阴性对照,采取单因素试验,对反应温度、甜菜碱浓度、Mg2+浓度、dNTPs 浓度、Bst 3.0 DNA 聚合酶浓度等条件进行优化,使用20×钙黄绿素-MnCl2显色液(含1 mmol/L 钙黄绿素、10 mmol/L MnCl2)进行显色,建立可视化LAMP 检测方法。
1.4.1 反应条件优化 受梯度PCR 仪温度设置程序限制,无法以1 ℃为梯度设置温度梯度,因此设置的 温 度 梯 度 为63.0、64.2、64.9、66.0、67.0、68.3、69.0 ℃;甜菜碱终浓度梯度设置为0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mol/L;Mg2+的终浓度梯度设置为2、4、6、8、10、12 mmol/L;dNTPs 的终浓度梯度设置为0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mmol/L;Bst 3.0 DNA聚合酶终浓度梯度设置为80、160、240、320、400、480 U/mL,反应结束后4 ℃冷却5 min,2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。
1.4.2 LAMP 体系灵敏度试验 为检测LAMP 可视化检测方法的灵敏度,将pCMV-ASFV-p72 质粒稀释至107、106、105、104、103拷贝/μL 的模板溶液,加入优化后的LAMP体系至106、105、104、103、102拷贝/μL,使用20×钙黄绿素-MnCl2显色液(含1 mmol/L 钙黄绿素、10 mmol/L MnCl2)进行显色,检测体系灵敏度。
1.4.3 LAMP 体系特异性试验 以实验室保存的分别含有ASFV p72、ASFV p54、ASFV p30、乙脑病毒(JEV)NS1、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白和猪流行性腹泻病毒(PEDV)N 蛋白编码基因的质粒为模板,加入优化后的LAMP 体系,使用20×钙黄绿素- MnCl2显色液进行显色,检测LAMP 体系特异性。
如图1 所示,综合电泳条带亮度及各条带浓度比例分析可知,LAMP 反应的最佳温度为67.0 ℃,LAMP 反应体系的最佳甜菜碱终浓度为1.25 mol/L,最佳Mg2+终浓度为8 mmol/L,最佳dNTPs 终浓度为1.25 mmol/L,最佳Bst 3.0 DNA 聚合酶终浓度为320 U/mL。
图1 反应条件优化
综上所述,优化后的LAMP 反应体系各成分终浓度为1×等温扩增缓冲液Ⅱ(含2 mmol/L MgSO4)、6 mol/L MgSO4、1.25 mol/L 甜 菜 碱、1.25 mmol/L dNTPs、1.6 μmol/L FIP、1.6 μmol/L BIP、0.2 μmol/L F3、0.2 μmol/L B3、320 U/mL Bst 3.0 DNA 聚合酶、1×钙黄绿素-MnCl2显色液、模板、ddH2O。
如图2 所示,当质粒模板浓度不低于103拷贝/μL 时,肉眼能够观察到体系发出的绿色荧光;当质粒模板浓度低于103拷贝/μL 时,肉眼不能观察到体系发出的绿色荧光。因此,优化后的LAMP 可视化检测方法灵敏度为103拷贝/μL 模板。
图2 灵敏度检测
如图3 所示,优化后的LAMP 可视化检测方法能成功检测出ASFVp72基因,而对ASFVp54基因、ASFVp30基 因、JEVNS1基 因、PRRSVN基 因、PEDVN基因等病毒基因无显色反应,具有良好的特异性。
图3 特异性检测
非洲猪瘟是由非ASFV 引起的一种高传染性、高致死率的猪烈性传染病[1,8]。2020 年8 月农业农村部发布的《非洲猪瘟常态化防控技术指南(试行版)》指出,非洲猪瘟的防控形势依然复杂严峻。一是境外疫情输入风险持续存在。二是病毒分布广,没有明显的地区、季节差异,并已在部分野猪群中定殖,根除难度进一步加大。根据农业农村部公布的数据显示,与2017 年相比,2020 年底生猪出栏头数减少1.75 亿头,同比减少24.93%;猪肉产量减少0.13 亿t,同比减少24.56%,猪肉价格也因此一直高于非洲猪瘟疫情发生前。因此建立灵敏度高、特异性强、成本低廉、操作简单的ASFV 现场检测方法,及时发现和处理疫病,对于防控非洲猪瘟至关重要。
LAMP 技术以其特异性强、灵敏度高、反应时间短、操作简单且鉴定便捷及时而受到研究人员青睐,目前已成功将该技术用于检测鉴定各类病原微生物、寄生虫、转基因成分、肿瘤、胚胎性别、食品过敏原等[9-11]。在针对ASFV 的检测方面,刘桂荣[12]针对ASFV 的B646L、E183L基因建立实时荧光LAMP 每管可检测出40 拷贝、分子信标LAMP 每管可检测出500 拷贝;王林等[13]依据商品化的荧光目视检测试剂盒建立针对p72基因建立的实时荧光LAMP 快速检测方法灵敏度为10 拷贝/μL;杨吉飞等[6]建立的可以检测到2 fg 的pGEM-T-vp72-E70 重组质粒,但没有进行可视化判定;韦莹华等[14]建立的Real-time LAMP 可在30 min 内检测低至100 拷贝/μL 的重组质粒;市面上部分qPCR 试剂盒灵敏度也在10~102拷贝/μL[15]。而本试验建立的LAMP 可视化检测方法可在60 min 内检测低至103拷贝/μL 的重组质粒,与常规PCR 的灵敏度持平或略微提高,进一步电泳结果表明,102拷贝/μL 的重组质粒能检测到但不足以进行显色反应,通过延长反应时间能进行显色反应。本试验采用的Bst 3.0 DNA 聚合酶不仅具有DNA 聚合酶活性,也具有高逆转录酶活性,能进行RT-LAMP 扩增,也能在样本不纯的情况下进行扩增;高彦萍等[16]使用Bst 3.0 DNA 聚合酶实现对马铃薯卷叶病毒的RT-LAMP 检测;Silva 等[17,18]使用Bst 3.0 DNA 聚合酶实现对寨卡病毒的RT-LAMP 检测,并证明RNA 酶抑制剂不影响Bst 3.0 DNA 聚合酶活性;因此本试验建立的LAMP 可视化检测方法不仅能够检测ASFV 基因组中的p72 序列,也能检测p72的mRNA,间接地提高了临床检测的灵敏度;考虑到质粒超螺旋构象与ASFV 基因组线性构象的差别,本试验建立的LAMP 可视化检测方法能适应基层和现场的检测要求。
综上所述,本试验基于环介导等温扩增(LAMP)技术,根据非洲猪瘟病毒p72基因保守序列设计一组LAMP 引物,采取单因素试验对LAMP 体系和反应条件进行优化,以钙黄绿素-MnCl2显色液进行可视化判定,灵敏度和特异性试验表明建立的LAMP 可视化检测方法具有很好的灵敏度和特异性。该方法较荧光定量PCR、ELISA 等检测方法对检测现场的仪器要求更低,仅需一个恒温水浴锅,反应时间更短,人员培训更简单,适合猪场和农户的现场检测。