益脾养肝方对大鼠肝癌前病变肝干细胞恶性转化的影响和作用机制

鞠 迪， 李 汨， 韩 曼， 房冰莹， 闫曙光， 李京涛

1 陕西中医药大学 a.陕西省中西医结合心血管病防治重点实验室, b.基础医学院， 陕西 咸阳 712046；2 陕西中医药大学附属医院 肝病一科， 陕西 咸阳 712000

肝细胞癌是人类最常见的恶性肿瘤之一[1]，多数患者发现时已至晚期，治疗预后差，5年内复发率高。肝癌前病变是肝纤维化、肝硬化发展为肝癌的过渡阶段[2]，其进展为恶性肿瘤的风险显著增加，如果能及时阻断这一恶变过程，就能阻止肝癌的发生。但目前肝癌前病变的发生机制仍未阐明，临床也缺乏相应的药物。因此，寻找控制或逆转肝癌前病变的分子机制具有重大理论意义。PI3K/Akt信号通路在维持干细胞增殖和多方向分化具有重要作用，PI3K/Akt信号通路的异常活化在肝干细胞周期失调、过度增殖过程中扮演重要角色[3-4]，可作为治疗慢性肝病的重要靶标[5]。益脾养肝方是陕西省名中医常占杰教授沿用多年的防治肝硬化进展的临床常用方，前期研究已证实该方能有效改善肝癌前病变患者临床症状[6]、抑制二乙基亚硝胺(DEN)诱发的大鼠肝癌前病变[7-12]，但作用机制尚不十分清楚。本研究旨在探讨益脾养肝方对肝干细胞恶性转化的影响，探讨其是否通过调控PI3K/Akt/mTOR通路抑制肝干细胞的恶性转化从而发挥抗肝癌前病变的作用，为该方的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠35只，体质量180～200 g，购自成都达硕生物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK(川)2020-24，使用许可证编号:SYXK(川)2019-189，实验动物正常饲养于温度20 ℃～24 ℃、相对湿度50%～60%环境，自由进食和饮水。

1.1.2 药物及制备 益脾养肝方由白术、党参、熟地、鳖甲、枸杞、半枝莲、郁金、姜黄、白花蛇舌草组成，于陕西中医药大学附属医院药剂科购买并制成每克生药含量为5 g的冻干粉，置4 ℃冰箱封存。使用时溶于100 ℃沸水，配制成中药汤液浓度为1.0 g/mL。护肝片由黑龙江葵花药业股份有限公司生产。

1.1.3 试剂及耗材 DEN购自美国Sigma公司；AST、ALT、 Alb测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；总RNA提取试剂盒购自天根生化技术有限公司；反转录试剂盒和SYBR®Green qPCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物有限公司；Akt、Phospho-Akt(Ser473)、PI3K p85、mTOR、Beta Actin抗体购自proteintech公司；Phospho-PI3K p85 (Tyr458) /p55 (Tyr199)、Phospho-mTOR(Ser2448)抗体购自Cell Signaling Techenology公司；谷胱甘肽S转移酶(GST3/GST pi)抗体购自abcam公司；OV6抗体购自R&D Systems公司；山羊抗兔IgG/HRP、山羊抗小鼠IgG/HRP抗体购自西安壮志生物科技有限公司；ECL显影液购自武汉博士德生物工程有限公司；兔SP试剂盒、鼠SP试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.1.4 主要仪器 冷冻型高通量组织研磨器(宁波新芝生物科技股份有限公司)、800TS吸收光酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)、超微量分光光度计(赛默飞世尔科技有限公司)、实时定量PCR(RT-PCR)仪(赛默飞世尔科技有限公司)、轮转式切片机(德国Leica公司)、YD-AB型摊烤片机、YD-6L型生物组织包埋机(金华市益迪医疗设备有限公司)。BX41/60型光学显微镜(日本Olympus公司)、化学发光凝胶成像系统(基因有限公司)，BS224S型电子分析天平(德国Sariorins公司)。

1.2 动物分组 35只大鼠随机分为4组：正常对照组(空白组)5只，DEN模型组(模型组)10只，DEN+护肝片组(护肝片组)10只，DEN+益脾养肝方组(益脾养肝方组)10只。除空白组外，其余各组均以0.5 mL/100 g的DEN腹腔注射，每周50 mg/kg(2次/周，即1次/84 h)，连续给药16周；空白组：给予同等条件的饲养与抓捕，同等时间点注射等量生理盐水。造模次日起益脾养肝方组给予浓度为1.0 g/mL的益脾养肝方药液灌胃，护肝片组按 921 mg/kg大鼠体质量灌胃，空白组、DEN组大鼠给予等量生理盐水灌胃。灌胃持续16周，1次/d。实验过程中，每周测量记录大鼠体质量。待实验周期结束，全部大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射(0.3 mL/100 g)，待大鼠麻醉后腹主动脉取血，收集血清，置于-80 ℃冰箱备用；取各组大鼠肝脏左叶约1 cm×1 cm×1 cm浸入4%多聚甲醛中，常温固定过夜后制作石蜡切片；取肝右叶组织约1 cm×1 cm×1 cm提取总蛋白和总RNA；其余肝组织置于-80 ℃冰箱备用。

1.3 研究方法

1.3.1 肝脏指数 采集大鼠肝脏，测量肝重比(肝脏指数)。肝脏指数(%)=肝脏重量/大鼠体质量×100%。

1.3.2 肝功能指标的检测 采集大鼠腹主动脉血，收集血清，检测ALT、AST和Alb水平。

1.3.3 肝脏病理组织观察 病理组织学采用苏木素-伊红(HE)染色和天狼星红染色观察各组大鼠肝损伤情况和胶原沉积情况，取各组大鼠肝脏左叶约1 cm×1 cm×1 cm浸入4%多聚甲醛中，常温固定过夜后制作石蜡，3 μm切片，经脱蜡、水化、染色、分化、透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察大鼠肝组织形态结构变化，随机选取3个视野进行图片采集，用Image-Pro Plus 6.0 软件对肝脏组织胶原沉积光密度值进行半定量分析。

1.3.4 免疫组化检测GST-Pi及OV6表达 石蜡切片经脱蜡、水化、抗原修复冷却后，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶的活性，0.05%BSA封闭，一抗4 ℃孵育过夜，PBS清洗，二抗室温孵育2 h，PBS清洗，三抗室温孵育30 min，PBS清洗，DAB显色，苏木素复染、脱水透明后封片。光学显微镜下随机选取3个视野进行图片采集，用Image-Pro Plus 6.0 软件对肝组织目的蛋白光密度值进行半定量分析。

1.3.5 Western Blot 检测 取50 mg肝组织加入蛋白裂解液，使用冷冻型高通量组织研磨器研磨提取总蛋白，BCA法检测总蛋白浓度；取20 μg蛋白上样后电泳，转膜，封闭。一抗Akt、Phospho-Akt(Ser473)、PI3K p85、mTOR、Beta Actin、Phospho-PI3K p85(Tyr458)/p55(Tyr199)、Phospho-mTOR(Ser2448)4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，加ECL显影液曝光。Image J分析计算条带的灰度值。

1.3.6 RT-PCR检测EpCAM、CD133和CD90表达 取50 mg肝组织，按RNA提取试剂盒说明提取总RNA，反转录为cDNA。根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)公布的大鼠基因序列，应用Primer 5软件设计引物(表1)，以cDNA为模板进行RT-PCR。采用三步法进行PCR扩增，反应结束后根据各样本CT值，利用2-ΔΔCT计算各组基因的相对表达量。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequences used in RT-PCR

2 结果

2.1 大鼠肝癌前病变的病理变化 造模过程中，空白组大鼠无死亡，余5只；模型组死亡1只，余9只；护肝片组死亡1只，余9只；益脾养肝方组无死亡，余10只。肉眼观察：空白组大鼠肝脏表面光滑，质地柔软，无明显病变出现；与空白组相比，模型组大鼠肝脏表面可见大量结节，分布不均且数量不等，部分肝组织可伴有淤血及肿块；益脾养肝方组和护肝片组肝脏表面粗糙，结节数量及程度较模型组减轻，其中益脾养肝方组改善作用更强。

HE染色显示：空白组大鼠肝细胞大小均一，排列整齐，以中央静脉为轴心呈放射状排列形成肝索，肝小叶结构完整；模型组大鼠肝细胞变性坏死，体积增大，核质比增加，肝索结构紊乱，并有广泛的炎性细胞浸润，形成大量假小叶；益脾养肝方组和护肝片组较模型组肝脏病理形态显著改善，变性坏死细胞明显减少，核质比相对降低，假小叶相对较少，炎性细胞浸润减少。天狼星红染色显示: 空白组汇管区血管有少量胶原沉积；模型组可见大量纤维条索将肝组织分割形成假小叶，胶原沉积显著增多(P<0.05)；益脾养肝方组和护肝片组纤维条索明显减少，肝脏分隔减少，胶原沉积显著减少(P值均<0.05)，益脾养肝方组比护肝片组更明显(图1，表2)。

表2 各组大鼠肝组织中胶原沉积半定量分析Table 2 Semi-quantitative analysis of collagen depositionin liver tissues of rats in various groups

2.2 大鼠肝脏指数和肝功能的比较 与空白组相比，模型组肝脏指数及血清中ALT、AST水平显著升高(P值均<0.01)，Alb显著降低(P<0.01)； 与模型组相比，益脾养肝方组和护肝片组肝脏指数及血清中ALT、AST水平明显下降(P值均<0.01)，Alb明显升高(P值均<0.01)。与护肝片组相比，益脾养肝方组肝脏指数及血清中ALT、AST水平明显下降(P值均<0.01)，Alb水平明显升高(P<0.01)。提示益脾养肝方和护肝片对DEN诱导的肝癌前病变模型大鼠肝损伤具有保护作用，且益脾养肝方组效果比护肝片组显著(表3)。

图1 肝组织HE染色和天狼星红染色(×100)Figure 1 Images of liver sections stained by Hematoxylin-Eosin (HE) and Sirius Red staining(×100)

表3 各组大鼠血清ALT、AST、Alb和肝脏指数比较Table 3 Comparison of ALT, AST, Alb and liver index in various groups

2.3 大鼠肝癌前病变组织中GST-Pi、OV6蛋白水平的变化 免疫组化结果显示，GST-Pi阳性灶主要分布在细胞胞浆中，呈圆形或不规则形棕黄色团块。空白组未见明显阳性表达；与空白组相比，模型组在汇管区周围及肝小叶内可见棕黄色阳性灶，且颜色较深，GST-Pi呈强阳性表达(P<0.05)；与模型组相比，益脾养肝方组和护肝片组大鼠肝组织GST-Pi表达显著下调(P值均<0.05)；与护肝片组相比，益脾养肝方组大鼠肝脏组织GST-Pi表达明显降低(P<0.05)。上述结果提示益脾养肝方和护肝片可抑制大鼠肝癌前病变的形成，且益脾养肝方组比护肝片组显著(图2，表4)。

免疫组化结果显示，OV6蛋白阳性灶主要分布在纤维间隔周围，呈棕黄或棕褐色。空白组未见明显阳性表达；与空白组相比，模型组OV6 表达显著升高(P<0.05)；与模型组相比，益脾养肝方组和护肝片组大鼠肝组织OV6表达显著下调(P值均<0.05)；与护肝片组相比，益脾养肝方组大鼠肝组织OV6表达明显降低(P<0.05)。上述结果提示益脾养肝方和护肝片可抑制大鼠肝癌前病变组织中肝干细胞标志物OV6的表达，且益脾养肝方组比护肝片组显著(图2，表4)。

注：GST-Pi免疫组化染色(×200)，OV6免疫组化染色(×400)。

表4 各组大鼠肝组织中OV6及GST-Pi含量半定量分析Table 4 Semi-quantitative analysis of OV6 and GST-Piin liver tissues of rats in various groups

2.4 益脾养肝方对大鼠肝癌前病变组织中EpCAM、CD133、CD90表达的影响 与空白组相比，模型组大鼠肝组织EpCAM、CD133和CD90 mRNA表达水平均显著增高(P值均<0.05)；与模型组相比，益脾养肝方组和护肝片组大鼠肝组织EpCAM、CD133和CD90 mRNA表达水平均显著降低(P值均<0.05)；与护肝片组相比，益脾养肝方组EpCAM、CD133和CD90 mRNA表达水平均显著降低(P值均<0.05)。上述结果提示益脾养肝方和护肝片可抑制大鼠肝癌前病变组织中肝癌干细胞标志物EpCAM、CD133和CD90的表达，且益脾养肝方组比护肝片组显著(表5)。

2.5 益脾养肝方可抑制大鼠肝组织PI3K/Akt /mTOR信号通路相关蛋白的磷酸化 Western Blot结果显示,与空白组相比，模型组大鼠肝组织p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表达均显著升高(P值均<0.05)；与模型组相比，益脾养肝方组和护肝片组大鼠肝组织p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表达均显著降低(P值均<0.05)；与护肝片组相比，益脾养肝方组大鼠肝组织p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表达均显著降低(P值均<0.05)。上述结果提示益脾养肝方和护肝片可抑制肝癌病变模型大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、Akt、mTOR的磷酸化，且益脾养肝方组比护肝片组显著(图3，表6)。

图3 PI3K/Akt/mTOR在DEN诱导肝癌前病变组织中的表达

3 讨论

癌前病变是一种临床常见的组织学改变，其进展为恶性肿瘤的风险高，及时阻断癌前病变的发生、发展，是癌症防治工作的重点。肝癌前病变是肝纤维化、肝硬化发展为肝癌的过渡阶段，目前肝癌前病变的发生机制尚未阐明，临床也缺乏相应的药物。随着大量且深入的临床疗效观察，中医药在防治肝癌及肝癌前病变方面展现出独特优势，可降低肝癌发生率、延缓疾病进程[13-15]。本着“未病先防”“既病防变”的思想，从整体观念出发，辨病与辨证相结合，以求能够更加客观把握疾病发生发展规律，为肝癌前病变的治疗研究提供了新思路[16]。益脾养肝方是陕西省名中医常占杰教授沿用多年的防治肝硬化进展的临床常用方，由党参、白术、熟地、枸杞、姜黄、鳖甲、郁金、半枝莲、白花蛇舌草九味药物组成，具有益脾养肝、行气活血、解毒散结的功效。临床研究[6]表明该方能有效改善肝癌前病变患者临床症状，缓解高危转癌风险患者的患癌率。已完成的实验研究[7-12]证实益脾养肝方显著减轻DEN诱发的大鼠肝癌前病变组织的病理形态，通过下调PCNA和GGT蛋白的表达，发挥抗细胞增殖、抗细胞氧化损伤的作用；通过抑制肝组织IL-6、TNFα、TLR4、NF-κB、STAT3等炎症相关因子的表达，降低炎症纤维化微环境对肝实质细胞的刺激作用；可提高CD3+、CD4+T淋巴细胞数量，降低CD8+T淋巴细胞数量，调控T淋巴细胞亚群数目和比例，增强机体免疫功能；可上调抑癌因子miRNA-124并下调致癌因子miRNA-221的表达，从而延缓肝癌前病变进展[7-12]。

表5 各组大鼠肝组织中EpCAM、CD133和CD90 mRNA相对表达量比较Table 5 Comparison of mRNA expression levels of EpCAM, CD133 and CD90 in various groups

表6 各组大鼠肝组织中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白半定量分析Table 6 Semi-quantitative analysis of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related protein in liver tissues of rats in various groups

GSTs是一组与机体解毒作用有关的酶类，其中GST-Pi可作为肝癌前病变的标志，是肝癌研究中检测癌前病变的常用指标[17]。GST-Pi在正常大鼠肝脏基本无活性，出现癌前病变时，肝细胞的去分化和肝干细胞的异常分化与增生可促进GST-Pi的表达。ALT、AST、Alb是评价肝功能的常用指标，本实验结果发现益脾养肝方可抑制肝癌前病变大鼠血清中ALT和AST的升高，提高Alb的水平，且明显改善大鼠肝组织病理形态，减少胶原沉积及假小叶的形成，降低肝癌前病变标志物GST-Pi的表达，表明益脾养肝方可明显抑制肝癌前病变的进展，与前期研究相符。

肝癌前病变的产生涉及炎症纤维化微环境的形成、肝癌干细胞的产生及二者相互作用并最终形成结节性病变。其中肝癌干细胞的产生是整个过程中最关键的步骤之一[18]。以往认为肝癌干细胞来源于成熟肝细胞的去分化，而越来越多的实验数据表明肝癌干细胞来源于肝干细胞的恶性转化[19]。肝干细胞主要存在于肝胆管末端Hering管，又称卵圆细胞，是慢性肝病患者肝脏中出现的一种具有多向分化潜能的原始细胞[20]。在肝细胞严重受损或分裂增生受到抑制时，肝干细胞可向肝细胞和胆管上皮细胞多向分化；当致癌因素存在时，可诱导肝干细胞活化增殖与恶性转化为肝癌干细胞[21]。已有研究报道PI3K/Akt信号通路在肝癌前病变进展中发挥重要作用。PI3K是细胞生长、增殖和迁移调控的第二信使，可通过下游Akt信号分子共同维持干细胞增殖和多方向分化。PI3K/Akt信号通路的异常活化在肝干细胞周期失调、过度增殖过程中扮演重要角色[3-4]，在肝纤维化、肝硬化和肝癌的发生发展中发挥重要作用，可作为治疗慢性肝病的重要靶标[5]。葛根素6-O-木糖苷[22]可通过抑制PI3K/AKT/mTOR降低肝癌细胞活力、增殖和干性，并促进了肝癌细胞自噬和线粒体依赖的凋亡；苦参碱衍生物[23]通过抑制PI3K/AKT信号通路减少肝癌干细胞富集；丹参多酚酸盐[24]通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路降低α-SMA、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的表达发挥抗纤维化的作用。本研究显示益脾养肝方可抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路中PI3K、Akt、mTOR蛋白的磷酸化，继而改善肝癌前病变。

本研究的创新之处在基于肝干细胞恶性转化在肝癌前病变中的作用，选择临床疗效确切的名中医经验方作为研究对象，从肝癌前病变出发，符合中医治未病理论。但益脾养肝方对肝干细胞恶性转化的影响尚未完全阐明，本研究结果显示益脾养肝方可降低肝干细胞标志物OV6的表达，同时可显著抑制肝癌干细胞标志物EpCAM、CD133、CD90的表达，表明益脾养肝方可抑制肝干细胞向肝癌干细胞的恶性转化，在一定程度上阐明了益脾养肝方抗肝癌前病变的作用机制。

综上所述，益脾养肝方可抑制大鼠肝癌前病变组织中肝干细胞恶性转化，其机制可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。本研究结果为益脾养肝方抗肝癌前病变的临床应用提供了理论基础，也为益脾养肝方抗肝癌前病变作用机制的深入探讨提供了一定的实验依据。

伦理学声明：本研究方案于2019年3月13日经由陕西中医药大学伦理委员会审批，批号：SUCMDL20211115001，符合实验室动物管理与使用准则。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：鞠迪负责课题设计，资料分析，撰写论文；李汨、韩曼负责收集数据，修改论文；房冰莹负责整理数据，统计分析；李京涛、闫曙光负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。