应用绿色液相色谱法定量检测发酵液中的乙醇

程娇梅，齐祥明，郭晓华

(1.中国海洋大学 食品科学与工程学院，山东 青岛 266000；2.青岛蔚蓝生物股份有限公司，山东 青岛 266000；3.山东美佳集团有限公司，山东 日照 276826)

1 引言

乙醇是很多酒精发酵液中的重要甚至是主要目标产物，乙醇含量往往是对这些发酵过程进行表征的重要指标之一。因此，快速、准确地测定乙醇含量对这类发酵工艺的优化与控制具有重要意义。传统的乙醇含量测定方法主要是通过密度原理进行检测[1]，需要对样品进行蒸馏处理，操作过程复杂，所需样品量相对较大，且测量结果不够准确，容易受温度以及糖等可溶性物质的影响。

目前，对于各种有机成分的快速、精确定量，往往习惯使用气相色谱或液相色谱。尽管有很多文献报道了采用气相、液相色谱对酒精发酵醪中多种有机成分的分析[2～4]，然而目前采用色谱法对其中乙醇成分进行定量检测的方法报道却非常少。仅有的几篇报道[5～9]，主要面向的样品通常为酒精饮料和醇基燃料。一些最新的文献以及国标[5,6]多采用气相色谱法，该类方法固然精确，但往往需要高纯氮气作为载气，运行成本偏高，不适合工业上酒精发酵醪的常规检测需求。另几项液相色谱检测法的文献中[7～9]，在原料基质相对简单的情况下，前处理过程都不够快捷和简便，且所用流动相往往为丙酮甚至乙腈等有机溶剂与水的混合物，运行、管理成本同样较高，也不符合绿色、环保的发展需求。

针对以上情况，本文通过对比选用了ShodexRSpak KC-811色谱柱，采用高效液相色谱，基于稀硫酸水溶液作为流动相，建立一种前处理简单、分析过程快速、分析结果精确可靠的乙醇定量检测方法。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

乙醇发酵液：青岛蔚蓝生物股份有限公司2019年2～12月采用酿酒酵母发酵所得的11批乙醇发酵液。分析用水，自制纯净水；硫酸：优级纯，国药试剂有限公司；乙腈：色谱纯，Merck公司；乙醇：色谱级(≥99.8%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

2.2 仪器

美国Waters公司生产的e2695高效液相色谱仪，主要包括四元梯度泵、2414示差折光检测器、柱温箱等。

2.3 样品前处理方法

取样品溶液适量，用水进行适当的稀释(稀释后乙醇含量大约为3 g/L)，12000 r/min离心5 min，用0.22 μm水系滤膜过滤。

2.4 色谱分析条件

2.4.1 色谱条件A

色谱柱：ShodexRSpak KC-811色谱柱；流动相：5 mmol/L硫酸溶液；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；检测器：示差检测器，检测器温度35 ℃。

2.4.2 色谱条件B

色谱柱：ShodexRSpak KC-811色谱柱；流动相：乙腈：水=75∶25(V∶V)；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；检测器：示差检测器，检测器温度35 ℃。

2.4.3 色谱条件C

色谱柱：Waters suger-I色谱柱；流动相：50 mg/L EDTA-钙溶液；流速0.3 mL/min；进样量10 μL；柱温90 ℃，检测器：示差检测器，检测器温度35 ℃。

3 结果与讨论

3.1 检测方法的对比

实验中首先选取了两种常见的阳离子色谱柱Waters Sugar-Pak I和ShodexRSpak KC-811，分别采用色谱条件C和色谱条件A进行了乙醇含量测定可行性探索，具体结果见图1。

图1 不同色谱柱的色谱

如图1所示，Waters Sugar-Pak I的乙醇保留时间(24 min)比ShodexRSpak KC-811(15min)长9 min，峰形较宽，且有一定程度的拖尾。从柱温条件上看，Waters Sugar-Pak I为90 ℃，也远高于ShodexRSpak KC-811的30 ℃。因此，从色谱结果和实验便捷角度考虑，决定选择ShodexRSpak KC-811作为建立相应乙醇含量测定方法的色谱柱。

确定选用ShodexRSpak KC-811色谱柱后，进一步实验选择较优的流动相，以获得更好的检测条件。实验采用3 g/L样品进行检测，对比了色谱条件B(以乙腈∶水=75∶25(V∶V)为流动相)和色谱条件A(以5 mmol/L硫酸溶液为流动相)的乙醇检测效果，具体结果如图2所示。

图2的结果显示，在其余条件均相同的情况下，以乙腈-水溶液作为流动相时，保留时间较稀硫酸水溶液缩短3min左右。然而，在化学分析相关领域广为人知的是，乙腈除了是非常好的流动相选择之外，同时其本身还是一种毒性挥发物[10]，操作危险性较高，使用后还需要较复杂的无害化处理。在绿色检测正逐渐成为业内共识的今天，采用乙醇、过热水、离子液体等替代乙腈的绿色液相色谱方案非常多见[9,11～15]，但却很少看到采用常温水溶液的方案。

图2 不同流动相的色谱

本研究用稀硫酸水溶液替代乙腈-水溶液作为流动相，除响应时间稍长于传统方案，其他各项性能甚至会优于传统方案。比如，从峰形上看，以硫酸溶液为流动相时，峰形相对更好。从峰面积上看，以硫酸溶液为流动相时，乙醇色谱峰(峰2)的峰面积为78719 μV·s，而以乙腈-水溶液为流动相时，乙醇色谱峰(峰1)的峰面积为48969 μV·s，结果表明在样品浓度相同的情况下，以硫酸溶液为流动相时响应值更高。因此，从色谱结果和环保角度考虑，本实验选择绿色液相色谱方案(条件A)用于乙醇含量的测定。

与文献[7～9]选择丙酮+水为流动相等相比，本实验选择5 mmol/L稀硫酸水溶液为流动相更绿色环保，不需要对后期废液进行特殊处理。综上所述，本实验选择ShodexRSpak KC-811色谱柱，采用色谱条件A进行乙醇含量测定方法的建立，并进行方法学考察。

3.2 方法学考察

3.2.1 线性关系考察

配制100 g/L的乙醇溶液，进行不同倍数的稀释，在规定的色谱条件下进行测定，做峰面积-乙醇含量的线性关系。如图3所示，采用规定的方法对乙醇进行含量测定时，其浓度在0.6～6 g/L范围内线性良好，R2可达0.9999以上。

图3 乙醇线性关系

本实验以信噪比(S/N)=3对应的含量作为检出限，通过对样品色谱图基线的分析，发现该方法下乙醇的检出限为11.67 mg/L。以信噪比(S/N)=10对应的含量作为定量限，可得出乙醇定量限为40.85 mg/L。

3.2.2 精密度试验

取乙醇对照品溶液，在规定的色谱条件下连续进样6 次，测定峰面积。计算乙醇峰面积的RSD为0.51%，结果表明该方法的精密度良好。

3.2.3 稳定性试验

取同一批供试品溶液，分别在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h按规定的色谱条件进样，结果乙醇峰面积的RSD为0.72%。表明供试品溶液中乙醇在24 h内稳定。

3.2.4 重复性试验

本实验选取5 个不同浓度的乙醇样品，在规定的色谱条件下，连续进样6 次，其峰面积RSD的平均值为0.6%，具体见表1。结果表明，所选方法在测定样品中乙醇浓度的重复性良好。

表1 乙醇重复性实验

3.2.5 加标回收率试验

取已知乙醇含量的样品9 份，加入3 种不同浓度水平的乙醇标准溶液，进行加标回收率试验(n=3)，具体结果见表2。结果表明，该方法的平均加标回收率为96.66%，回收率的RSD为1.3%，说明回收率良好，适合于本样品的含量测定。

表2 乙醇加标回收率实验

3.3 样品含量测定

检测方法建立后，对检测方法的性能进行确认，以保证建立的检测方法适用样品的检测。本实验分别对10批乙醇发酵醪样品(2019年2～12月)进行了的5次平行测定，结果如表3所示，其酒精含量测定值的RSD最高为3.06%，小于5%，符合定量检测方法要求。

表3 样品含量测定

4 结论

本文基于色谱柱、流动相的选择和优化，建立了高效液相色谱法测定乙醇发酵液中乙醇含量的方法。前处理仅采用去离子水对样品稀释，然后用0.22 μm水系滤膜过滤即可上样。具体色谱条件为，色谱柱为ShodexRSpak KC-811色谱柱；流动相为5 mmol/L硫酸溶液；流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL；柱温为30 ℃；检测器为示差检测器，检测器温度为35 ℃。

试验进一步确定和验证了该方法的线性范围、重复性、加标回收率等。结果表明，该分析方法在乙醇浓度0.6～6.0 g/L范围内线性度良好，R2=1；检出限为11.67 mg/L；定量限为40.85 mg/L；加标回收率为96.66%，样品重复性(RSD)小于1.0%。发酵醪的分析结果显示，其酒精含量测定值RSD最高为3.06%。与现有文献的充分对比显示：该方法样品处理简单，对乙醇含量的测定快速、准确、可靠，值得乙醇发酵领域检测乙醇浓度时借鉴使用。