异养硝化好氧反硝化菌研究进展

慕 浩，王亚娥，李 杰,2，胡凯耀，朱红娟，易宏学，张莉红,2,3

(1.兰州交通大学 环境与市政工程学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省非常规水资源化利用技术重点实验室，甘肃 兰州 730020；3.甘肃省膜科学技术研究院有限公司，甘肃 兰州 730020)

1 引言

氮素是引起水体富营养化的主要原因之一，传统脱氮工艺应有相应的缺氧、好氧生物反应器或通过间歇曝气等手段控制反应器内溶解氧量，来达到生物脱氮的目的。然而，反应器占地面积大、回流管道多、需额外投加碱度是目前污水处理厂所面临的瓶颈，因此如何从废水中高效脱氮且减少处理成本是污水处理厂的焦点问题。

同步硝化反硝化(SND)有占地小、运行管理方便等优势，拥有良好的发展前景[1]。目前存在3种理论解释SND，即宏观环境、微环境和微生物学理论[2]。宏观环境理论认为反应器内氧扩散不均匀，引起局部好氧、缺氧环境进而实现SND。微环境理论认为，由于氧传质过程具有阻力，使活性污泥外部呈好氧态，内部呈缺氧态，以此实现SND。Robertson等[3]分离出的第一株HN-AD菌Thiosphaerapantotropha，从微生物学角度阐明了实现SND的机理。

区别于自养硝化和缺氧反硝化，异养硝化指微生物利用水中有机物将氨氮转化为亚硝氮和硝氮的过程，而好氧反硝化则是在好氧条件下进行的反硝化过程，HN-AD菌就是一类既拥有异养硝化功能又拥有好氧反硝化功能的微生物。常见的HN-AD菌主要是革兰氏阴性菌，主要属于假单胞菌属(Pseudomonassp.)[4]、产碱杆菌属(Alcaligenessp.)[5]、副球菌属(Paracoccussp.)[6]、不动杆菌属(Acinetobactersp.)[7]、无色杆菌属(Achromobacterdenitrificanssp.)[8]等。部分真菌也具有HN-ND功能，如杨晓华[9]分离出的Fusariumsp.A60可在氨氮或硝氮作为唯一氮源下生长，并且具有良好的脱氮效率。

目前对HN-AD菌的研究大多停留在实验室阶段，很难应用于实际，因为HN-AD菌直接投加至废水中易于流失，难以成为优势菌种[10]。本文对HN-AD菌的影响因子、相关酶系等方面进行了综述，并且对未来HN-AD菌的研究方向进行了展望。

2 HN-AD菌生长及脱氮效果的影响因子

影响HN-AD菌生长及脱氮效果的因素众多，其中研究较为广泛的是碳源种类、C/N比、温度和酸碱度。部分HN-AD菌最佳参数及脱氮性能见表1。

表1 部分HN-AD菌最佳参数及脱氮性能

2.1 碳源种类

HN-AD菌可以利用多种有机碳源，如柠檬酸盐、乙酸钠、丁二酸钠、琥珀酸钠、蔗糖、乙醇等。不同碳源会不同程度地影响HN-AD菌，这反映在不同的O2利用量、N2O产生量和亚硝酸盐积累量上[11]。据报道[12]，柠檬酸盐作为碳源时，Alcaligenes faecalis strain WT14脱氮效率最高，原因可能是柠檬酸盐分子结构简单，柠檬酸根离子可以直接参与菌体的三羧酸循环，更有利于脱氮。N2O是一种常见的温室气体，大部分HN-AD菌最终反硝化产物为N2O而不是N2，因此如何减少N2O产生量广泛受学者关注。

此外，来自石油、制药、焦化等行业产生的难降解有机物对传统硝化反硝化菌有生物毒害作用，导致其生长及脱氮机能受抑制。而一些HN-AD菌却可以利用一些难降解有机物作为碳源。如Lu Hong等[13]分离出的Rhodococcus pyridinivorans GF3可降解9种蒽醌类物质。Bai Yaohui等[14]分离出的Shinella zoogloeoides BC026可以以吡啶为唯一碳、氮源对其进行降解。而Pseudomonas sp. BC001[15]以喹啉为碳、氮源，可完成对有机物和氮素的去除。

2.2 C/N比

C/N比会显著影响细菌的生长及脱氮效果。低C/N比不能为细胞生长和反硝化提供足够的能量和电子供体，同时，过高的C/N比可能会抑制细菌的生长繁殖[16]。由于HN-AD菌种类繁多且代谢机理不同，此类菌对C/N比的适应范围较广，大多数HN-AD菌适宜的C/N比在10左右，高于传统硝化、反硝化菌[17～19]。Pseudomonas stutzeri strain XL-2[19]在C/N比为10时脱氮效率最高，可去除97.9%的硝酸盐氮； Sang Chiguo等[20]分离的Bacillus sp. SC16在C/N比为8时降解效率最高。

由于HN-AD菌所需C/N比普遍较高，难以处理低C/N比废水，这是异养硝化-好氧反硝化脱氮所面临的挑战之一。Huang Tinglin等[21]从饮用水蓄水池分离出的Pseudomonas stutzeri strain ZF31在C/N比为3时对总氮去除率达到73.30%。筛选耐低C/N比的菌株是当前研究的热点。

2.3 温度和pH值

温度和pH值对HN-AD菌生长、繁殖起重要影响，不适于细菌生长的温度、pH值会导致菌体酶的活性降低，甚至死亡。大多数HN-AD菌的最适温度范围为25～37 ℃，最适pH值范围为7.0～7.5[22～24]。Zhu Liang等[25]筛选出的Pseudomonasmendocina3-7最适温度为30 ℃，当温度下降到10 ℃时，其总氮去除率由原来的89.9%降为9.4%。Pseudomonasmandelii[26]在pH值为5的条件下，好氧反硝化相关酶的活性大大降低。然而，一些HN-AD菌可在极端温度和pH值条件下生长繁殖并且对氮素进行去除。李振轮[27～29]等分离出的PseudomonasmonteiliiStrainH97、PseudomonasputidaY-12、ArthrobacterarilaitensisY-10均可以在15℃的条件下保持良好的脱氮效果。其中PseudomonasmonteiliiStrainH97在pH值为12.0时，对硝氮和总氮的去除率仍有64.75%和36.78%，为一株耐冷嗜碱HN-AD菌。Jingrui Yang等[30]筛选出的Acinetobactersp. JR1在pH值为4.5时仍具有良好的脱氮效果。从极端环境下筛选分离耐高低温、耐酸碱的菌株也是目前的研究热点之一，根据我国废水处理实际情况，耐低温菌株具有更好的应用前景。

3 HN-AD菌相关酶系及氮代谢途径

截至目前，已分离的HN-AD菌分属于不同属、种，菌株的多样性导致研究其代谢途径和机理相对困难，因此其详尽的代谢途径及机理尚不明确。目前的研究主要集中于分析相关酶系及测定脱氮中间、最终产物来推测其脱氮途径。

3.1 相关酶系

参与异养硝化过程的酶有氨单加氧酶(AMO)、羟胺氧化酶(HAO)和亚硝酸盐氧化还原酶(NXR)。而硝酸盐还原酶(NR)、亚硝酸盐还原酶(NIR)、一氧化氮还原酶(NOR)和一氧化二氮还原酶(NOS)则参与好氧反硝化过程。HAO为异养硝化过程的关键酶，NR和NIR为好氧反硝化过程的关键酶。其详细作用原理见图1。

图1 参与好氧反硝化过程的酶作用原理

羟胺氧化酶(HAO)是一种周质酶，不同的菌种可能会纯化出不同类型的HAO，如从Bacillussp. K5[36]中纯化出的HAO与Acinetobactersp. Y16[37]纯化出的HAO在大小、最大速率、最适温度、最佳pH值等方面均不同。目前学者[38]对自养硝化菌的HAO有详细研究，但对异养硝化菌的HAO却缺乏详细研究。异养菌的HAO不含血红素，酶的活性可被Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)显著促进[39]，这说明在异养硝化体系中加入铁离子可能会促进HAO活性，从而提高硝化效率。

硝酸盐还原酶(NR)进一步可分为异化硝酸盐还原酶(NRs)、同化硝酸盐还原酶(Nas)和真核硝酸盐还原酶(eukNR)[40]。Nas参与细菌同化作用，eukNR存在于真核生物中，在此不做讨论。NR分为周质硝酸盐还原酶(Nap)和膜结合硝酸盐还原酶(Nar)。Nap可在好氧条件下表达，因此通常测定Nap的活性来判断细菌是否具有好氧反硝化特性。Nap是一种异二聚体酶，含有一个催化亚单位(NapA)和一个电子转移亚单位(NapB)。NapA是大亚基，含有两个氧化还原活性中心：钼活性中心和铁硫簇。NapB是小亚基，含c型细胞色素，是生物体中电子传递的一个重要组成部分[39, 40]。

亚硝酸盐还原酶(NIR)有两种：Cytcd1型亚硝酸盐还原酶，编码基因为nirS；Cu型亚硝酸盐还原酶，其编码基因为nirK[41]。这两种类型的亚硝酸盐还原酶均可在好氧反硝化过程中起重要作用，但一般不同时出现在同一菌株当中[42]。据报道：PseudomonasaeruginosaATCC 9027[43]和PseudomonasstutzeriX31[44]依赖nirS编码的酶进行亚硝酸盐还原反应，从Ochrobactrumanthropi和Alcaligenesfaecalis中则扩增出了nirK编码基因[45]。

3.2 氮代谢途径

为达到同步硝化反硝化脱氮，微生物体必须拥有硝化和反硝化的相关酶。目前已经提出2种可能的氮代谢途径来解释异养硝化-好氧反硝化过程。

第一种途径为氨氮被氧化成羟胺，随后羟胺被氧化成亚硝氮和硝氮，而硝氮(亚硝氮)又逐渐被还原成氮气的过程。此途径中硝化反应的相关酶AMO和HAO可被检测，反硝化反应的相关酶NR、NIR也可被检测。如PseudomonasalcaliphilaAD-28[46]中，AMO和HAO的酶活力分别为0.112 U/mL和0.012 U/mL，NR和NIR的酶活力为0.108 U/mL和0.043 U/mL。

第二种途径是通过中间体羟胺将氨氮直接转化成为含氮气体的过程。如Hungsoo Joo等[22]发现在好氧条件下，AlcaligenesfaecalisNo.4中检测不到反硝化相关酶的存在，推测最终生成的N2O可能是由铵氧化产生的羟胺生成。Zhao Bin等[47,48]的研究成果更进一步的证明了此观点。AcinetobactercalcoaceticusHNR[47]在好氧条件下既没有NR也没有NIR被检测到。然而，其HAO的酶活力为0.051 U/mL，AlcaligenesfaecalisstrainNR[48]中HAO酶活力则高达0.063 U/mL，同时检测不出反硝化相关酶。这表明铵氧化产生的羟胺在HAO酶的作用下直接转化成了N2O等气态产物，该途径将脱氮过程大大简化，对氮循环和废水处理具有重要意义。

4 展望

HN-AD菌在SND体系中具有重要意义，目前学者们的主要研究方向为该类菌株的分离、鉴定和影响因素的探究，未来的研究方向应该侧重于以下几个方面。

(1)把单一的HN-AD菌和其他菌株复合或通过微生物固定化等技术，来提高其在实际应用中的稳定性。

(2)HN-AD菌所需的C/N比普遍较高，处理低C/N比废水困难，因此筛选最佳C/N比较低的菌株具有重要意义。

(3) HN-AD菌脱氮最终产物大多为N2O，而N2O是导致温室效应的主要原因之一，因此如何减少N2O的产生量也是未来研究热点之一。