大蒜素对子宫内膜异位症大鼠异位病灶及缺氧诱导因子-1α表达的影响

董秀娟，曹若愚，于洪基，窦素棉

(沧州市中心医院，河北 沧州 061000)

子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs)是育龄期女性常见的妇科疾病之一，发病率约10%，病程反复、迁延难愈，是导致痛经、盆腔痛甚至不孕的重要原因[1-2]。EMs发病机制尚未明确，其中经血逆流种植学说得到普遍认可[3]；腹腔为乏氧微环境，所以适应缺氧是内膜细胞种植成功的关键[4]。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是细胞缺氧适应能力最重要的调控因子，HIF-1α高表达在EMs发生发展过程中发挥着重要调控作用[5-6]。

大蒜素是由百合科葱属植物大蒜的鳞茎中提取的一种二烯丙基三硫化物，具有抗炎、抗肿瘤、调节免疫力等多种药理学作用[7-9]，并且能够通过下调HIF-1α表达对糖尿病大血管病变起到保护作用[10]。本研究通过自体内膜移植的方法制备大鼠EMs模型，以孕三烯酮作为阳性对照药物，探讨大蒜素对EMs大鼠异位病灶及HIF-1α表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雌性SD大鼠65只，7周龄，体重170～200 g，购自河北省实验动物中心[实验动物生产许可证号：SYXK(冀)2018-004]。分笼饲养于沧州医学高等专科学校[实验动物使用许可证号：SYXK(冀)2019-006]，饲养环境温度23～25 ℃、相对湿度50%～70%、光照时间12 h，实验方案经沧州市中心医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 药物与试剂 大蒜素胶囊(江苏正大清江制药有限公司，批号：20200324)；孕三烯酮胶囊(北京紫竹药业有限公司，批号：1911016)；戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司，批号：J20190812)。HE试剂盒(河北博海生物有限公司,批号：20200104)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、转化生长因子-β1(TGF-β1)酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005、SEKRT-0401)；兔源HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)、β-肌动蛋白(β-actin)抗体和羊抗兔IgG二抗(北京博奥森生物科技有限公司,bs-20399R、bs-1313R、bs-0061R、bs-0295G)；增强型化学发光(ECL)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号：SW2030)。

1.3 主要仪器 Vevo2100型小动物超声仪(加拿大Visual Sonics公司)；LKB-Ⅲ型超薄切片机(瑞典LKB公司)；HT7700型透射电镜(日本 Hitachi公司)；Varioskanlux型多功能酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；AI09型光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；VE180型电泳槽、VE186型转膜仪(上海天能科技有限公司)；Gel Doc 2000 凝胶成像系统(美国 Bio-Rad公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 EMs大鼠模型制备：取55只实验用大鼠，参照文献[11]自体内膜移植法制备EMs大鼠模型：造模前3 d开始1次/d灌胃给予戊酸雌二醇(0.1 mg/kg)，以调节大鼠动情周期使其同时发情；腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)实施麻醉后，于尿道上端约2 cm处开腹、暴露左侧子宫，结扎左侧子宫角并剪取约1 cm长度的子宫，置0.9%氯化钠水溶液中并剪成0.5 cm×0.5 cm子宫内膜组织块，将其移植到右侧腹壁皮下筋膜层、腹壁肌层之间，逐层缝合，常规饲养；假手术组行模型组相同的手术通路、结扎并切除左侧子宫角，但不进行自体移植。4周后，通过小动物超声仪检测，腹壁下方可见暗灰色低回声区，即为异位病灶，病灶内黑色无回声区则提示病灶内有液体，通过图像分割测量异位病灶体积≥50 mm3，则认为造模成功。

1.4.2 分组与给药：取50只模型大鼠按照随机数字表法分为模型组、孕三烯酮组(阳性对照组)和大蒜素低、中、高剂量组；另10只大鼠设为假手术组。孕三烯酮组灌胃给予0.5 mg/kg的孕三烯酮溶液[12]，大蒜素低、中、高剂量组分别灌胃给予5、10、20 mg/kg的大蒜素溶液(根据临床人有效剂量折算大鼠用量，分别为最佳剂量的0.5、1、2倍)，假手术组和模型组灌胃给予0.9%氯化钠水溶液，灌胃容量均为5 ml/kg，给药频次均为1次/d，疗程4周。

1.4.3 异位病灶的外观检查及盆腔粘连评分、病灶体积测量：末次给药6 h后，实施麻醉后开腹，用4 ml 0.9%氯化钠水溶液冲洗腹腔并收集腹腔液，待检。取假手术组大鼠在位子宫内膜组织及其它组大鼠内膜异位病灶，用0.9%氯化钠水溶液冲洗干净后，通过肉眼观察各组大鼠异位病灶大体外观及形态。参照Haber评分方法进行异位病变的盆腔粘连评分[13]。通过卡尺测量异位病灶的长(mm)、宽(mm)、高(mm)，然后按椭球体积计算公式计算病灶体积(Volume，V)，V(mm3)=0.52×长×宽×高。

1.4.4 HE染色法行子宫内膜组织病理学检查：取部分在位(假手术组)子宫内膜组织或内膜异位病灶组织，置4%多聚甲醛溶液72 h后，依次进行常规石蜡包埋、5 μm厚度切片、梯度乙醇脱蜡水化后行HE染色，用中性树脂封片后通过光学显微镜观察在位子宫内膜组织组织或内膜异位病灶病理学改变。

1.4.5 透射电子显微镜观察子宫内膜细胞超微结构变化：取小块在位子宫内膜组织或内膜异位病灶组织，切割成约1 mm×1 mm×1 mm组织块后依次浸入2.5%戊二醛溶液固定24 h、1%锇酸溶液固定3 h，冲洗后进行梯度乙醇脱水、环氧树脂浸透包埋后，80 nm厚度超薄切片，经铀铅双染色后通过透射电子显微镜细胞超微结构变化。

1.4.6 ELISA法检测腹腔液中TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1含量：取“1.4.3”提取的腹腔液，经3000 r/min离心10 min后取上清液，然后按照ELISA试剂盒说明检测腹腔液中TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1含量。

1.4.7 Western blot法检测子宫内膜组织HIF-1α、VEGF蛋白表达：取每只大鼠约50 mg在位子宫内膜组织或内膜异位病灶组织，加入4 ℃预冷裂解液后匀浆，冰上静置30 min提取总蛋白，4 ℃、12000 r/min离心20 min后取上清液，BCA法检测总蛋白浓度，每孔等量上样后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿法转PVDF膜，加5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，洗膜后滴加HIF-1α(1∶800)、VEGF(1∶1000)、β-actin(1∶3000)抗体4 ℃孵育过夜，洗膜后滴加IgG二抗(1∶5000)室温孵育1.5 h，洗膜后滴加ECL后通过凝胶成像系统显示蛋白条带，然后以目标蛋白条带灰度值与β-actin(内参)条带灰度值的比值半定量目标蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 大蒜素对EMs大鼠子宫内膜异位病灶大体外观的影响 模型组子宫内膜异位病灶为内含淡黄色液体的囊泡样结构，形态饱满，呈圆形或椭圆形，与盆腔粘连，异位病灶表面可见新生血管生成；与模型组相比，大蒜素低、中、高剂量组和孕三烯酮组子宫内膜异位病灶均明显缩小，囊内液体减少，形态欠饱满，外形欠规则，与盆腔粘连状况减轻，新生血管减少；大蒜素上述作用呈剂量依赖性，大蒜素高剂量组效果优于其它组。

2.2 大蒜素对EMs大鼠子宫内膜异位病灶盆腔粘连评分和病灶体积的影响 与模型组相比，大蒜素中、高剂量组和孕三烯酮组异位病灶盆腔粘连评分、病灶体积均显著降低(P<0.01)；与孕三烯酮组相比，大蒜素高剂量组异位病灶盆腔粘连评分、病灶体积均显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 大蒜素对EMs大鼠子宫内膜异位病灶盆腔粘连评分和病灶体积的影响

2.3 大蒜素对EMs大鼠子宫内膜病理学改变的影响 假手术组在位子宫内膜柱状上皮细胞和间质细胞排列整齐、致密；模型组子宫内膜异位病灶柱状上皮细胞排列整齐、间质细胞致密、新生血管明显增生、炎性细胞浸润等病理学改变；大蒜素低、中、高剂量组和孕三烯酮组上皮细胞脱落、间质疏松、新生血管和炎性细胞明显减少，异位内膜不同程度剥脱；大蒜素上述作用呈剂量依赖性，大蒜素高剂量组效果优于其他组。见图1。

图1 大蒜素对EMs大鼠子宫内膜病理学改变的影响(HE染色，×200)

2.4 大蒜素对EMs大鼠子宫内膜细胞超微结构改变的影响 假手术组在位子宫内膜上皮细胞核膜完整、核仁清晰、线粒体结构正常；与假手术组相比，模型组子宫内膜异位病灶上皮细胞核膜完整、核仁清晰，线粒体形态、结构正常但数量明显增多；与模型组相比，大蒜素低、中、高剂量组和孕三烯酮组子宫内膜异位病灶上皮细胞脱落、间质疏松、新生血管和炎性细胞明显减少，线粒体呈现肿胀、脊断裂溶解、脊间隙增大等超微结构改变；其中大蒜素高剂量组上述效果优于其它组。见图2。

图2 大蒜素对EMs大鼠子宫内膜细胞超微结构改变的影响(透射电子显微镜，×7000)

2.5 大蒜素对EMs大鼠腹腔液中TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1含量的影响 与假手术组相比，模型组TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β1含量均显著升高(P<0.01)；与模型组相比，大蒜素中、高剂量组和孕三烯酮组TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β1含量均显著降低(P<0.01)；与孕三烯酮组相比，大蒜素高剂量组TNF-α、IL-6、TGF-β1含量均显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 大蒜素对EMs大鼠腹腔液中TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1含量的影响(ng/L)

2.6 大蒜素对EMs大鼠子宫内膜组织HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响 与假手术组在位子宫内膜相比，模型组子宫内膜异位病灶HIF-1α、VEGF蛋白表达显著升高(P<0.01)；与模型组相比，大蒜素低、中、高剂量组子宫内膜异位病灶HIF-1α、VEGF蛋白表达显著降低(P<0.01)；与孕三烯酮组相比，中、高剂量大蒜素组子宫内膜异位病灶HIF-1α、VEGF蛋白表达显著降低(P<0.01)。见图3、表3。

A：假手术组；B：模型组；C：大蒜素低剂量组；D：大蒜素中剂量组；E：大蒜素高剂量组；F：孕三烯酮组图3 大蒜素对EMs大鼠子宫内膜组织HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响

表3 大蒜素对EMs大鼠子宫内膜组织HIF-1α、VEGF蛋白相对表达量的影响

3 讨 论

EMs是最常见的妇科疾病之一，与育龄期女性50%的不孕症及80%的痛经有关，并且EMs作为一种良性疾病，却具有恶性肿瘤般侵袭及远处转移的能力，给女性造成极大的生理和心理负担[14]。EMs病理机制复杂，近年来研究发现乏氧在EMs疾病进展过程中发挥着重要作用，为EMs新型治疗药物研究提供了有效靶点。

在中医EMs属“痛经”“癥瘕”“月经病”“不孕”等范畴，瘀血阻滞、气血运行不畅是EMs的重要病理机制。大蒜为百合科葱属植物，其鳞茎可入药，性温、味辛甘，大蒜素是其主要活性成分，具有活血化瘀、益气解毒、宣通温补之功效[15]。孕三烯酮是临床治疗EMs的常用药物，能够通过对抗雌激素而抑制子宫内膜异位病灶的生长。大鼠具有饲养成本低、动情周期短、自发排卵等特点，移植造模法主要分为自体、同种异体、异种异体移植法，其中自体移植法具有与人体EMs病理特点接近、异位灶种植部位准确等优势[16]。本研究采用自体移植法制备EMs大鼠模型，以孕三烯酮为阳性对照药物，结果显示，经大蒜素治疗后异位病灶明显缩小，粘连评分降低，异位病灶上皮细胞呈现脱落、间质疏松且新生血管明显减少，上皮细胞线粒体数量明显减少且呈现肿胀、脊断裂溶解、脊间隙增大等超微结构改变，腹腔液中炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量和TGF-β1含量明显降低，并且大蒜素高剂量组降低异位病灶体积、降低粘连评分、诱导异位病灶及其上皮细胞超微结构改变的作用优于孕三烯酮组，提示大蒜素对EMs大鼠异位病灶生长及炎症反应具有抑制作用。

EMs的发生进展与腹腔内乏氧微环境状态的适应性密切相关[17]。HIF-1是调控细胞对缺氧微环境适应性的关键调控因子，HIF-1是由HIF-1α、HIF-1β两种亚基形成的二聚体，其中HIF-1α为氧敏感型，在常氧下状态下能够被泛素-蛋白酶系统迅速降解，乏氧则阻断泛素-蛋白酶系统而抑制HIF-1α降解，HIF-1α能够调控一系列靶基因的转录表达而提高细胞对乏氧的适应能力[18]。因此，HIF-1活性主要依赖于HIF-1α亚基。VEGF为HIF-1α靶基因，是促进血管生成的强刺激因子[19]。此外，HIF-1α具有稳定线粒体结构与功能的作用，可能与HIF-1α调控钙离子浓度、抑制氧自由基生成等有关[20]。本研究结果显示，EMs模型大鼠异位病灶HIF-1α、VEGF蛋白表达明显上调，与祁建青等研究结果基本一致；进一步研究发现，经大蒜素治疗后异位病灶HIF-1α、VEGF蛋白表达明显下调。

综上所述，大蒜素对EMs大鼠异位病灶生长具有抑制作用，其机制可能与下调HIF-1α表达，抑制异位病灶血管新生、诱导线粒体损伤有关，但HIF-1α对线粒体的调控机制还有待于进一步研究。