针刺对急性期脑出血大鼠M1型小胶质细胞的影响

曹洪涛，于学平，戴晓红，滕 伟，匡炳霖，于薇薇，李明月，邹 伟△

(1．黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2．黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

脑出血(Intracerebral Hemorrhage,ICH)是卒中患者预后最差的疾病之一，全球范围内发病率约为24.6/100 000，且发病早期死亡率极高，幸存者多遗留有运动、感觉、语言等不同类别、不同程度的功能障碍，支持性护理是目前治疗本病的主要方法[1-3]。ICH发生后的最初几个小时由于血肿或水肿压迫造成原发性脑损伤，引起占位效应和颅内压升高，从而导致脑疝和死亡。继发性脑损伤是由小胶质细胞激活引起的，小胶质细胞会驱动促炎、氧化和细胞毒性级联反应，导致细胞死亡和功能障碍[4]。小胶质细胞作为关键的先天免疫细胞，在应对急性脑损伤时，激活后的小胶质细胞可以动态地和暂时地改变它们的表型，发展成经典激活(M1型，产生促炎介质)或替代激活(M2型，产生抗炎介质)表型，被认为是对ICH等各种急性脑损伤做出反应的第一个非神经元细胞[4-6]。最初发生脑出血等急性脑损伤时，M1型小胶质细胞/巨噬细胞在损伤区域占据主导地位，并产生大量IL-1β等促炎因子，促进炎症反应加剧脑损伤[7]。

笔者先前研究表明，针刺百会透曲鬓穴可以抑制Mincle、Syk、CARD9的免疫反应和蛋白表达，降低脑组织中促炎因子IL-1β的含量，减轻脑出血后炎性损伤，改善脑出血后的神经功能障碍[8]。但从针刺能否抑制激活后M1型小胶质细胞方面探讨针刺对脑出血脑保护作用的研究较少。本实验以M1型小胶质细胞标记物(CD86、iNOS)及炎症因子(IL-1β)作为观察指标，观察针刺对脑出血大鼠M1型小胶质细胞及炎症的影响，探讨本法治疗脑出血的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究选取的147只体质量为(280±20)g、年龄为7～8周的健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠,均购买于黑龙江中医药大学[证书编号：SCXK(黑龙江)2017-004]，所有大鼠可自由获得洁净水源和标准食物，并在温度(20±2)℃和湿度(50±5)%可控的动物房中进行12 h光照/黑暗周期饲养。所有动物实验均已获得黑龙江中医药大学动物伦理委员会的批准(批准号：2020-09-24-01)。并依据美国国立卫生研究院的动物护理和使用指南进行。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 仪器 立体定位仪(ST-5ND-C，中国成都仪器厂)；台式牙钻机(307-6型，中国上海齿科医械厂)；电泳仪(DYY-7C，北京六一仪器厂)；石蜡包埋机(JB-L5，武汉俊杰电子有限公司)。

1.2.2 试剂 CD86多克隆抗体(bs-1035R，北京博奥森生物技术有限公司，中国)；iNOS多克隆抗体[ab49999，艾博抗(上海)贸易有限公司，中国]；白介素1β(IL-1β) ELISA检测试剂盒(WLE03，沈阳万类生物科技有限公司，中国)。

1.3 实验设计和分组

随机将147只大鼠分为假手术组、模型组及针刺组，每组49只，将所有组分为4个亚组，6 h组(n=10)、1 d组(n=10)、3 d组(n=19)和7 d组(n=10)，分别在治疗后6 h、1 d、3 d和7 d时，各亚组均取10只大鼠评定各组大鼠改良的神经功能缺损评分，然后处死大鼠，取脑组织样本进行HE染色，评价针刺对脑组织病理损伤及神经功能的影响；3 d时各组大鼠相关治疗结束后，空白组、模型组及针刺组均取9只大鼠脑组织样本，进行Western blot检测(每组3只)、免疫荧光染色(每组3只)及ELISA试剂盒检测(每组3只)，评价针刺对M1型小胶质细胞标记物的影响。

1.4 造模方法

将小鼠通过腹膜内注射2 %戊巴比妥钠(40 mg / kg)麻醉后，固定在立体定位仪中。用牙钻(前囟点后0.2 mm，右侧3.5 mm)钻一个毛刺孔(直径1 mm)，直到到达脑膜。从大鼠尾静脉采集50 μL自体血，然后将微量注射器在立体定位仪上固定，将针头沿钻孔进针约6 mm，以20 μL/min速度注射到尾状核，5 min后缓慢取出微量注射器。然后用牙科水泥封住穿刺口，缝合皮肤，最后对伤口进行包扎和消毒。假手术组进行脑出血模型制备的各项手术操作，但不注血。造模完成后，待大鼠清醒，依据 Berderson 评分法[9]对造模后大鼠进行评分。评分1～3分的大鼠被作为脑出血成功模型，纳入实验。

1.5 干预方法

1.5.1 假手术组 进行脑出血模型制备的各项手术操作，但不注血。

1.5.2 模型组 仅进行脑出血模型制作，不做任何干预治疗。

1.5.3 针刺组 造模成功后12 h，对大鼠进行针刺治疗。针刺部位参照《实验针灸学》[10]选取大鼠百会穴(顶骨正中)及大鼠曲鬓穴(患侧)(右眶外缘与右外耳门连线的后2/3)。操作方法：选用规格为0.30 mm×25 mm的一次性使用针灸针(华佗；苏州)从百会穴透刺至患侧曲鬓穴，然后选用经过至少24 h训练的针灸医师将针以(190±10)r/min 的速度进行左右交替旋转，持续刺激5 min后休息5 min，连续治疗3次。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 神经行为学评价 选用改良的神经功能缺损评分[11](modified Neurological Severity Score，mNSS)评价各组大鼠神经功能。

1.6.2 HE染色 灌注后，切取大鼠出血部位中心位置前后2 mm的脑组织，包埋，切取4 μm厚的组织切片，HE染色，高倍镜观察病理损伤。

1.6.3 Westernblot检测脑组织CD86、iNOS蛋白表达 取冻存于-80 ℃冰箱的各组脑组织，将脑组织匀浆离心后分离上清取上清液，经BCA法测定蛋白浓度。20 μL处理后的蛋白样品加入电泳槽中进行电泳，转膜，5 %脱脂奶粉封闭，相应条带分别加入一抗CD86(1∶1 000)、iNOS(1∶500)，4 ℃孵育过夜。漂洗好PVDF膜后加入二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育45 min。洗涤后缓慢摇动洗涤5 min×6次，滤纸吸干水分后，静置反应5 min，最后将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带的光密度值。

1.6.4 免疫荧光 脑组织取出后，放入10 %的多聚甲醛并置入4 ℃冰箱中固定24 h后，包埋，切片，脱蜡，水化后，PBS洗5 min×3次。切片放入含有柠檬酸PH6.0修复液的修复盒，中火5 min煮沸，停火保温5 min，低火10 min。冷却后PBS洗5 min×3次，加入一抗CD86(1∶200)、iNOS(1∶2 000)，4 ℃避光过夜。室温放置复温30 min，PBS洗5 min 3次，滴加荧光二抗，二者均用PBS 1∶200稀释，室温避光孵育60 min。PBS洗5 min 3次，滴加DAPI，复染核8 min。PBS洗5 min 3次，盖玻片封片，荧光显微镜下观察和计数。

1.6.5 ELISA检测 取大鼠脑组织匀浆上清进行ELISA检测，具体步骤严格按照试剂盒操作说明书操作。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 3组大鼠mNSS评分比较

造模前所有大鼠mNSS评分均为0分。假手术组术后均未见明显神经功能缺损表现。模型组与针刺组大鼠于造模后6 h时均表现出神经功能缺损症状，1 d、3 d及7 d时均有神经缺损症状；针刺组与模型组比较，各时间大鼠神经功能评分均明显降低(P<0.01)。见表1。

2.2 3组大鼠HE染色结果

6 h、1 d、3 d和7 d时，假手术组大鼠基底节区可见脑组织形态结构正常，少量炎性细胞浸润，无出血点。模型组大鼠在造模6 h后可见大量血细胞溢出，神经纤维肿胀，神经元数量减少;1 d时大量血细胞溢出，炎性细胞增多；术后3 d时：脑组织形态结构改变严重，大量炎性细胞浸润，大量血细胞溢出；术后7 d时，出血范围及炎性细胞减少。与模型组相比，针刺组各时间点出血灶范围缩小，炎性细胞相对降低，脑组织病理结构破坏程度降低。见图1。

表1 3组大鼠mNSS评分比较

图1 3组大鼠HE染色结果

2.3 3 d时3组大鼠脑组织CD86蛋白比较

假手术组可见CD86蛋白弱阳性表达；模型组CD86蛋白表达明显增高。与模型组比较，针刺组CD86蛋白表达明显降低(P<0.05)。见图2、表2。

图2 3 d时3组大鼠脑组织CD86蛋白比较

表2 3 d时3组大鼠脑组织CD86蛋白比较

2.4 3 d时3组大鼠脑组织iNOS蛋白比较

假手术组可见iNOS蛋白少量表达；模型组iNOS蛋白表达明显增高。与模型组比较，针刺组iNOS蛋白表达明显降低(P<0.05)。见图3、表3。

图3 3 d时3组大鼠脑组织iNOS蛋白比较

表3 3 d时3组大鼠脑组织iNOS蛋白比较

2.5 3 d时3组大鼠CD86、iNOS免疫荧光双染结果

免疫荧光双染示3组大鼠均有CD86、iNOS共表达阳性细胞；与假手术组比较，针刺组、模型组CD86、iNOS共表达阳性细胞明显增多；与模型组比较，针刺组CD86、iNOS共表达阳性细胞数明显减少。见图4。

2.6 3 d时3组大鼠IL-1β ELISA检测结果

假手术组大鼠脑组织IL-1β表达较低；与假手术组比较，模型组、针刺组脑组织IL-1β表达明显升高(P<0.01)；与模型组比较，针刺组脑组织IL-1β表达明显降低(P<0.01)。见表4。

图4 3 d时3组大鼠CD86、iNOS免疫荧光双染结果

表4 3 d时3组大鼠IL-1β ELISA检测结果比较

3 讨论

脑出血在中医学属“中风病”范畴，针刺治疗本病疗效确切，其中头针治疗本病效果更为显著[12]。百会位居巅顶，属督脉，各经脉气会集之所，通经舒络。曲鬓穴为足太阳、足少阳交会穴，其通经舒络、调达气血，具有振颓疗瘫的作用。早在古籍《普济方》中就有“凡忽中风，言语謇涩，半身不遂……穴百会，耳前发际曲鬓穴”的记载。现代临床研究证明，针刺百会透曲鬓穴能够提高治疗脑出血的临床疗效，降低患者神经功能缺损程度[13]；动物研究证实针刺百会透曲鬓穴能够减轻脑出血后炎性损伤，改善脑出血后的神经功能障碍[8，12]，说明头针在抑制炎症、减轻神经功能障碍方面具有重要作用。

小胶质细胞是大脑的主要吞噬细胞，ICH后被脑损伤迅速激活，发展成经典激活(M1型，促炎)或替代激活(M2型，抗炎)表型，在 ICH 中具有双重作用[14]。活化的小胶质细胞可通过吞噬血肿以及细胞碎片，进而维持受损组织稳态，促进神经功能恢复。但在此过程中，活化的小胶质细胞也会产生多种有害细胞因子，如促炎因子(IL-1β)等，增加脑出血后脑损伤[15-16]。虽然在ICH急性期整体 M1和 M2标记物水平都增加，但流式细胞术表明小胶质细胞主要发展为M1表型[17-18]，其已被证明会产生促炎因子，且激活后M1型小胶质细胞的数量与神经功能损伤相关[19]。Wang等[20]实验结果表明增强小胶质细胞驱动的炎症反应，加剧小鼠脑出血后的脑损伤。抑制ICH后激活的M1型小胶质细胞，有助于减轻炎症诱导的继发性脑损伤，起到脑保护作用[4]。同时，小胶质细胞与炎性反应相关炎性因子具有密切联系。炎性反应作为ICH重要的病理机制，多项研究证实炎症因子IL-1β与ICH后继发性脑损伤关系密切[21-22]。

本实验采用mNSS评分法观察到模型组与针刺组大鼠于造模后6 h时均表现出神经功能缺损症状，1 d、3 d及7 d时均有神经缺损症状；针刺组与模型组比较，各时间大鼠神经功能评分均明显降低，说明针刺可以降低ICH大鼠神经功能评分，有效改善神经功能缺损症状。模型组大鼠在造模6 h后可见大量血细胞溢出，神经纤维肿胀，神经元数量减少;1 d时大量血细胞溢出，炎性细胞增多；术后3 d时：脑组织形态结构改变严重，大量炎性细胞浸润，大量血细胞溢出;术后7 d时，出血范围及炎性细胞减少。与模型组相比，针刺组各时间点上述病理情况均有所减轻，表明针刺能够减轻脑出血大鼠的脑组织炎性损伤。经Westernblot检测可见，模型组CD86、iNOS蛋白表达明显增高。与模型组相比，针刺组CD86、iNOS蛋白表达明显降低，说明针刺能够抑制CD86、iNOS蛋白表达。经免疫荧光双染示3组大鼠均有CD86、iNOS共表达阳性细胞；与模型组比较，针刺组CD86、iNOS共表达阳性细胞数明显减少。同时，ELISA试剂盒检测IL-1β可见模型组、针刺组脑组织IL-1β表达明显升高,与模型组比较针刺组脑组织IL-1β表达明显降低，说明针刺能够有效降低ICH大鼠脑组织炎症因子IL-1β表达。

综上，针刺百会透曲鬓穴可能通过抑制M1型小胶质细胞，降低炎症因子IL-1β表达，减轻ICH后炎症损伤，改善神经功能缺损症状，发挥脑保护作用。但针刺如何抑制M1型小胶质细胞活化，及是否通过促进M1型小胶质细胞向M2型极化，进而降低炎症因子IL-1β表达，尚需进一步论证，以期为临床治疗本病提供新思路。