7-羟基香豆素的抑菌活性及其稳定性研究

张国财 安吉缘 徐震霆 马伟虎 孙赫明 柴守权

（1. 东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2. 国家林业和草原局森林和草原病虫害防治总站，辽宁 沈阳 110034）

植物病害是影响农作物优质高产的重要制约因素之一，在多种植物病害中，70%～80%的病害是由植物真菌侵染所致，每年造成巨大的经济损失[1]，而且部分病原真菌分泌产生的毒素与代谢物能引起人畜中毒，对农产品的安全构成了威胁[2]。目前的防治方法主要是采用化学防治，化学防治具有效率高、速度快及杀虫抗菌谱广的优点[3]。但是近年来，大量的化学农药被应用于农林生产上，使土壤中的有益菌等大量死亡，土壤肥力大量流失，造成了环境污染[4]，使我国农林业产业化发展受到很严重的影响[5-7]。

香豆素类化合物是一类具有苯环和吡喃酮内酯环结构的有机化合物，经常以单体或糖苷的形式存在于芸香科（Rutaceae）、伞形科（Umbelliferae）、菊科（Compositae）、豆科（Leguminosae）等高等植物中，而香豆素和7-羟基香豆素都是香豆素类化合物的母体。近年来，学者们陆续发现了香豆素类化合物可以有效抑制真菌的生长[8]。

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）属半知菌亚门，是植物枯萎病的主要病原菌。由致病性尖孢镰刀菌侵染引起的植物枯萎病是一种世界性的土传真菌病害，病菌从根部为害植物，引起维管束病害，造成植株枯死，在植株的全生育期均可发生，对生产造成了具大的损失。国内外已报道的被严重为害的作物有棉花（Gossypium hirsutum）、番茄（Lycopersicon esculentum）、黄瓜（Cucumis sativus）、哈 密 瓜（Cucumis melo）、西瓜（Citrullus lanatus）、大豆（Glycine max）、豇豆（Vigna unguiculata）等[7]；灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）是植物灰霉病的病原菌，可以侵染蔷薇科（Rosaceae）、菊科（Asteraceae）、茄科（Solanaceae）、葫芦科（Cucurbitaceae）、豆科等500多种植物[9]；樟子松枯梢病（Sphaeropsis sapinea）主要危害以松属为主的针叶树种，病害可以在苗木至成熟的大树的芽、叶、梢和根茎发病，可以引起30多种苗木和大树的枯梢[10]；樟子松黑点针枯病菌（Pestalotiasp.）危害杉科（Taxodiaceae）、柏科（Cupressaceae）、松科（Pinaceae）中等多种针叶树，针叶在病害侵染初期在出现坏死性暗褐色或呈黄褐色病斑，使得全针叶迅速变黄枯死[11]；杨树烂皮病菌（Cytospora chrysosperma）是杨树的重要枝干病害病原，有性阶段为污黑腐皮壳（Valsa sordida），无性阶段为金黄壳囊孢菌（Cytospora chrysosperma）。病害初期会影响树木生长，出现放叶晚、叶片变小、枯枝、枯干等病状，后期会造成树木成片死亡[12]。目前防治植物病害的主要方法是培育抗病品种、使用化学药剂和利用农业措施等，但由于病菌的抗药性，在防治中后期往往效果都不太理想。而生物农药[9]对人类健康安全无害、对环境友好、超低用量、高选择性的优势为防治植物病害提供了更为广阔的空间[13-15]。

研究采用生长速率法，研究了7-羟基香豆素对尖孢镰刀菌、灰葡萄孢菌、樟子松枯梢病菌、樟子松黑点针枯病菌、杨树烂皮病菌菌丝生长的抑制作用。并以尖孢镰刀菌为指示菌，测试了光照、氧化剂、还原剂、酸碱和金属离子处理的条件下，7-羟基香豆素抑菌活性的稳定性，旨在为7-羟基香豆素的开发利用和以7-羟基香豆素为主的生物农药的剂型开发提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 菌株及培养基

尖孢镰刀病菌、灰葡萄孢、樟子松枯梢病菌、樟子松黑点枯梢病菌、杨树烂皮病菌由东北林业大学林学院森林保护学科提供。

7-羟基香豆素（纯度99%）为北京酷尔化学科技有限公司生产，其他化学试剂为国产分析纯。PDA培养基：200 g马铃薯，17 g琼脂，20 g葡萄糖，水1 000 mL。

1.2 试剂和仪器设备

GR85DA立式自动压力蒸汽灭菌器（ZEALWAY，美国）；SPX-70BE生化培养箱（上海力辰邦西仪器科技有限公司，中国）；BJ-2CD净化工作台（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司，中国）；JA2003电子天平（精确到1mg，上海舜宇恒平科学仪器有限公司，中国）。葡萄糖、琼脂、H2O2、KCl、NaOH、HCl、Na2SO3、CaCl2、NiCl2、CoCl2、MnCl2（上海国药试剂集团）。

1.3 7-羟基香豆素的抗菌活性测定实验

将0.032 g的7-羟基香豆素溶解在5 mL蒸馏水中，然后与15 mL的PDA培养基（降温到50 ℃）充分混合[16]，倒进灭菌后的培养皿中制成含有7-羟基香豆素的培养基平板。在平板中心分别接入植物病原菌菌饼（5 mm），并让有菌丝的一面紧贴培养基，每种病原菌为1个处理，每个处理重复3次。以15 mL冷却至50 ℃的PDA培养基为CK1，放置于25 ℃的恒温培养箱培养，等到CK1菌落长满菌丝时，测量处理组菌落直径，按公式（1）计算7-羟基香豆素的抑菌率[17]。

1.4 7-羟基香豆素抑菌活性的稳定性实验

1.4.1光照耐受度测定

在光照和黑暗条件下，分别测定0.35 mg/mL的7-羟基香豆素对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制作用，每组处理重复3次。CK2为黑暗条件下的7-羟基香豆素溶液，黑暗条件下则用锡纸包住，用十字交叉法每隔24 h测定每个处理菌落的生长直径，计算抑菌率[18]。

1.4.2氧化剂耐受性测定

将1 mL体积分数为0.05、0.01、0.015的H2O2溶液加入5 mL的7-羟基香豆素溶液中，静置24 h后，再加入14 mL的PDA培养基相混合，每组处理重复3次[19]。CK3为浓度为0.35 mg/mL的7-羟基香豆素溶液，72 h后用十字交叉法测定每个处理菌落的生长直径，计算抑菌率。

1.4.3还原剂耐受性测定

将1 m质量浓度为0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL的NaClO2溶液与5 mL的浓度为0.35 mg/mL的7-羟基香豆素溶液充分混合，静置24 h后，再加入14 ml的PDA培养基相混合，每组处理重复3次。CK4为浓度为0.35 mg/mL的7-羟基香豆素溶液，72 h后用十字交叉法测定每个处理菌落的生长直径，计算抑菌率。

1.4.4金属离子耐受性测定

将KCl、CaCl2、NiCl2、CoCl2、MnCl2分别配制成质量浓度为5、10、20、30 mg/mL的溶液，各取1 mL与5 mL的质量浓度为0.35 mg/mL的7-羟基香豆素溶液混合，静置24 h后，再与14 mL的PDA培养基相混合，放于培养平板中,每组处理重复3次。CK5为浓度为0.35 mg/mL的7-羟基香豆素溶液，72 h后用十字交叉法测定每个处理菌落的生长直径，计算抑菌率。

1.4.5酸碱耐受度测定

将质量浓度为0.35 mg/mL的7-羟基香豆素装入10 mL离心管，用已经配好的1 mol/L盐酸和1 mol/L NaOH分别调节pH，使pH分别为5、6、7、8、9，放置24 h后进行测定，每个处理重复3次。CK6为浓度为0.35 mg/mL的7-羟基香豆素溶液，72 h后用十字交叉法测定每个处理菌落的生长直径，计算抑菌率。

1.5 数据分析

采用SPSS 21.0软件对数据进行差异显著性分析，数据处理间差异显著性检验根据不同需求采用Duncan's分析，采用Origin Pro 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 7-羟基香豆素的抑菌效果分析

将5种病原菌接种在含有7-羟基香豆素的培养基上培养5 d后，测定7-羟基香豆素对病原菌的抑制作用，结果见表1。由表1可知，7-羟基香豆素对5种病原菌均表现出强烈的抑制作用。当7-羟基香豆素浓度为1.6 mg/mL 时，对尖孢镰刀菌的抑制作用最好，对尖孢镰刀菌的抑菌率可达93.66%，对樟子松黑点针枯病菌的抑菌率为90.66%，而对灰葡萄孢菌的抑制作用最低，为85.66%。

表 1 7-羟基香豆素对真菌的抑菌率Table 1 Antifungal rate of 7-hydroxycoumarin %

2.2 7-羟基香豆素抑菌作用的稳定性分析

2.2.1对光照的耐受性分析

由图1可知，在光照下，经过0～72 h处理，7-羟基香豆素的抑菌活性没有显著性变化，当光照到达72 h时，7-羟基香豆素的抑菌活性仍达67.00%，与CK2无显著差异。由此可见，7-羟基香豆素的抑菌活性不受光照影响。

2.2.2对氧化剂的耐受性分析

由图2可知，7-羟基香豆素在经过不同体积分数的过氧化氢溶液处理后，对7-羟基香豆素的抑菌率达到65%，与CK3相比差异不显著。

2.2.3对还原剂的耐受性分析

由图3可知，与CK4相比，抑菌率在60%左右，说明亚硫酸钠对7-羟基香豆素的影响差异不显著。

图 3 亚硫酸钠对7-羟基香豆素的影响Fig. 3 Effect of NaC2SO3 on 7-hydroxycoumarin

2.2.4对金属离子的耐受性分析

由图4a可知，CK5抑菌率为64.33%，7-羟基香豆素的抑菌率随着K+的浓度先升高后降低，由73.67%降低到42.33%，当K+质量浓度为30 mg/mL时，7-羟基香豆素抑菌率为42.33%，与CK5相比，抑菌率下降了22%。经过Ca2+的处理后，7-羟基香豆素的抑菌率无显著变化。由图4b可知：7-羟基香豆素在经过不同浓度的Mn2+的处理后，抑菌率不断升高，抑菌率从70.66%升到81%，当Mn2+质量浓度为30 mg/mL时，7-羟基香豆素的抑菌率为81%，与CK5相比，抑菌率提高了17%，而7-羟基香豆素在经过不同浓度的Co2+、Ni2+处理后，抑菌率均为100%，与CK5相比，抑菌率提高了36%。

图 4 金属离子对7-羟基香豆素的影响Fig. 4 Effect of metal ions on 7-hydroxycoumarin

2.2.5对酸碱耐受度分析

由图5可知，pH为7时，抑菌率为75.33%。在pH 5～6时，7-羟基香豆素的抑菌作用很高，抑菌率为100%，与CK6相比，抑菌率提高了21.34%，在pH 8～9时，抑菌率逐渐降低，但是与CK6相比，抑菌率分别下降了3.33%、8.66%。

图 5 酸碱对7-羟基香豆素的影响Fig. 5 Effect of acid-base on 7-hydroxycoumarin

3 结论与讨论

香豆素以及香豆素类化合物是一类具有苯骈α-吡喃酮母核的天然化合物的总称，具有抑菌、抗癌、抗炎和抗氧化活性[20]。本研究以7-羟基香豆素为研究对象，研究目标化合物在不同条件下的抑菌活性，结果表明7-羟基香豆素对尖孢镰刀菌、灰葡萄孢菌、樟子松枯梢病菌、樟子松黑点枯梢病菌、杨树烂皮病菌均有不同程度的抑制作用，尤其是对尖孢镰刀菌抑制作用更为显著。7-羟基香豆素能够抑制多种病原菌，杨亮[21]通过香豆素类化合物抑菌活性筛选，得出16种香豆素类化合物对青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）都有不同程度的抑菌活性，刘广路[22]研究了香豆素类化合物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）2种革兰氏阳性菌和大肠杆菌（Escherichia coil）、柱状黄杆菌（Flavobacterium columnaris）2种革兰氏阴性菌都显示不同程度的抑菌活性。史燕晨等[23]研究了3-香豆素甲酸乙酯类化合物的制备与抗真菌活性，发现对苹果腐烂病菌（Valsa mali）、苹果轮纹病菌（Botryospuaeria berengeriana）、玉米弯孢病菌（Alternaria alternate）等12种植物病源在50 mg/mL有不同的抑菌活性。胡林峰等[24]从伞形科白芷甲醇提取物白芷乙醇提取物为0.100 g/mL时，对棉花黄萎病菌（Ver-ticillium dahliae）、小麦赤霉病菌（Gibberella zeae）、苹果炭疽病菌（Glomerella ciningulaia）和番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）等植物病原真菌菌丝生长有一定程度的抑制作用。周淑敏等[25]研究发现白芷（Angelica dahurica）中香豆素提取液对细菌、霉菌和酵母均有很强的抑制作用。魏艳等[26]研究发现7-羟基-香豆素硝基衍生物，对苹果腐烂病菌及苹果轮纹病菌有抑菌作用。

当7-羟基香豆素浓度为1.6 mg/mL，抑菌率为93.66%。经过光照、氧化剂、还原剂的处理后，抑菌活性相对稳定；在酸性条件下抑菌活性得到增强，在碱性条件下抑菌活性逐渐降低；在经过金属离子的处理后，发现在Ca2+的处理下，7-羟基香豆素的抑菌活性无显著变化，在经过Mn2+、Ni2+、Co2+的处理后，抑菌活性显著增强，在经过K+处理后，7-羟基香豆素的抑菌活性显著下降。

本研究利用不同金属离子处理7-羟基香豆素后表现出不同的抑菌活性：经K+的处理后，7-羟基香豆素的抑菌活性下降，其原因可能是随K+的浓度增高，抑制了7-羟基香豆素的抑菌活性；在经过Ca2+的处理后，7-羟基香豆素的抑菌率基本上没有变化,说明7-羟基香豆素的抑菌活性受到Ca2+的影响很小。而在经过Mn2+、Co2+、Ni2+的处理后，抑菌活性提高，其原因可能是3种金属离子抑制了尖孢镰刀菌的生长[27]，导致7-羟基香豆素的抑菌活性提高。

在pH 5～9之间，7-羟基香豆素能保持很好的抑制效果，在酸性条件下，抑菌效果更好，抑菌率达100%，可能是酸抑制了尖孢镰刀菌的生长。随着pH增加，抑菌率不断降低，原因可能是碱性环境抑制了7-羟基香豆素的抑菌活性。这与兰江林等[28]研究尖孢镰刀菌在酸性条件下生长速度缓慢的结果一致。7-羟基香豆素在经过氧化剂和还原剂的作用后，抑菌效果也十分稳定。其原因可能是在一定浓度范围内，氧化剂对7-羟基香豆素抑菌效果无显著影响。