褪黑素对鱼藤酮致帕金森病大鼠运动功能和炎症反应的影响

董琬玥，王 璐，王赫明，刘桦美，林 松（通信作者），李瑞琪，唐松远

（1 齐齐哈尔医学院基础医学院 黑龙江 齐齐哈尔 161006）

（2 齐齐哈尔医学院口腔医学院 黑龙江 齐齐哈尔 161006）

帕金森病（parkinson’s disease, PD）是一种神经退行性疾病，其以肌僵直、静止性震颤为主要症状[1]。目前，PD 的发病机制依然不明确，临床上对它的治疗方法大多为对症治疗。目前，炎症发生已经被证实与许多和年龄相关的慢性神经退行性疾病有关，其中促炎与抗炎的失衡被广泛认为是PD 发生的机制之一。尸检发现，PD 患者黑质区呈现以小胶质细胞激活状态及细胞应激为特征的慢性炎症反应，因此寻找抑制炎症反应的新药，或许可以为延缓PD 提供新的方向。

鱼藤酮是一种被广泛使用的杀虫剂，可以用作帕金森病动物模型造模试剂。其良好的脂溶性以及能够穿透血脑屏障的能力使其较容易地造成黑质中多巴胺能神经元损伤，同时，作为帕金森中典型病理变化之一的路易小体也可在施加鱼藤酮后被观察到[2]，因此本实验采用鱼藤酮来建立大鼠PD 模型。

褪黑素是一种能够调控人体昼夜节律以及性成熟的激素。它还具有能够调节免疫功能的特性，如其可以促进自然杀伤细胞、T 细胞以及单核细胞等的激活和增值，并促进细胞因子如IL-1、IL-12 和IFN-γ 等的释放。其抗炎特性可以通过COX-2 的下调和NO 的抑制来介导[3]。本实验通过建立帕金森大鼠模型来观察补充褪黑素对PD大鼠的炎症反应和运动症状的效果，并探究其可能的机制。

1.资料与方法

1.1 材料和分组

选取2020 年6 月—2021 年7 月齐齐哈尔医学院动物实验中心的实验动物为健康清洁的SPF 级雄性Wistar大鼠，共36 只，体重280 ～350 g。饲养过程中维持温度、湿度正常。大鼠按随机数表法分三组：对照组、PD造模组、PD+褪黑素组，每组12 只。

1.2 制备动物模型及行为学评分

将大鼠适应性喂养1 周，然后利用颈背部皮下注射法注射鱼藤酮进行造模。PD 造模组和PD+褪黑素组注射鱼藤酮，按照2 mg/kg/d的剂量进行。对照组采用等量0.9%氯化钠溶液注射，其余操作一致，持续36 d。造模结束后参考陈忻[4]等方法对36 只大鼠进行行为活动的观察及行为学评分来评估其造模程度，2 ～8 分视为符合造模标准。

1.3 药物干预

将PD+褪黑素组造模成功的大鼠腹腔注射褪黑素5 mg/（kg·d）、持续2 周，PD 造模组以及对照组注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.4 行为学实验

1.4.1 旷场试验 实验全程保持安静，将大鼠预先置于旷场中使其自由探索10 min。正式实验开始后，采用旷场实验系统自动录制大鼠在旷场5 min 内的活动以得到运动总路程和平均运动速度。

1.4.2 转棒实验 对各组实验大鼠采用转棒式疲劳仪进行预训练。预训练时将大鼠置于转棒上，逐渐加速至40 r/min,训练时间为2 d、15 min/d。2 d 后将转棒仪设置为40 r/min 进行正式实验，每只大鼠测试3 次并取均值，记录大鼠从转棒开始旋转到离开转棒的时长作为在棒时间。

1.5 样品采集

将完全麻醉的大鼠快速断头、取脑；之后迅速用事先冰存的0.9%氯化钠溶液将脑洗净；根据大鼠脑立体定位图在冰盒上小心分离黑质和纹状体，称重后低温保存。

1.6 ELISA 法检测指标

将样品组织和冷藏的PBS 溶液加入玻璃匀浆器，并将匀浆器置于碎冰中将脑组织充分研磨，之后将匀浆液放入离心机中以3 000 转/min 离心20 min；离心结束，将所得上清液吸取储存于低温冰箱。最后按照试剂盒的标准方法测定NF-κB、TH、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。

1.7 统计学方法

2.结果

2.1 各组行为学评分

注射鱼藤酮36 d 造模后，对照组各项行为反应正常，毛色干净无发黄；PD 造模组和PD+褪黑素组出现静止震颤等帕金森样症状；对PD 模型组和PD+褪黑素组大鼠进行行为学评分，结果为2 ～8 分，表明全部造模成功，见表1。

表1 各组造模后的行为学评分比较（只）

2.2 各组转棒实验和旷场实验比较

在旷场实验中，与对照组相比，PD 造模组大鼠运动总路程减少，运动平均速度减慢，差异有统计学意义（P＜0.05）；相较于PD 造模组大鼠，PD+褪黑素组大鼠运动总路程增加，平均速度有所提高（P＜0.05）；在转棒实验中，对比对照组，PD 造模组大鼠在棒时间有所减少（P＜0.05）；与PD 造模组大鼠相比，PD+褪黑素组大鼠在棒时间有所增加（P＜0.05），见表2。

表2 各组旷场实验和转棒实验比较（± s）

表2 各组旷场实验和转棒实验比较（± s）

注：#与对照组相比：P ＜0.05；*与PD 造模组相比：P ＜0.05。

转棒实验运动总路程/m平均运动速度/（mm·s-1）在棒时间/s对照组1215.50±3.2651.65±10.875.60±1.11 PD 造模组1210.30±3.50# 34.35±11.68#3.64±0.63#PD+褪黑素组1214.00±2.02* 46.65±6.74*5.03±1.15*F 6.156.158.4 P＜0.01＜0.01＜0.01旷场实验组别只数

2.3 褪黑素处理对黑质TH 和NF-κB 水平的影响ELISA 检测TH 和NF-κB，结果显示：PD 造模组大鼠黑质TH 水平相较对照组表达水平低（P＜0.05），PD+褪黑素组大鼠黑质TH 表达水平相较PD 造模组高（P＜0.05）；PD 模型组大鼠黑质NF-κB 表达水平相较对照组高（P＜0.05）。PD+褪黑素组大鼠黑质NF-κB 水平相较PD 造模组低（P＜0.05），见表3。

表3 各组间TH 和NF-κB 水平比较（± s）

表3 各组间TH 和NF-κB 水平比较（± s）

注：#与对照组相比：P ＜0.05；*与PD 造模组比较，P ＜0.05。

组别只数THNF-κB对照组12165.08±10.86196.57±11.09 PD 造模组12142.91±9.58#215.28±12.50#PD+褪黑素组12153.99±8.74*198.81±11.51*F 10.215.99 P＜0.01＜0.01

2.4 褪黑激素处理对纹状体炎症因子的影响ELISA检测结果表明，PD 造模组大鼠纹状体内炎症因子IL-1β，IL-6 以及TNF-α 相较对照组有所升高，差异具统计学意义（P＜0.05）。PD+褪黑素组大鼠纹状体炎症相较造模组获得一定程度缓解，TNF-α 和IL-1β、IL-6，水平相较PD 造模组均降低（P＜0.05），见表4。

表4 各组间TNF-α 和IL-1β 和IL-6 水平比较（± s）

表4 各组间TNF-α 和IL-1β 和IL-6 水平比较（± s）

注：#与对照组相比：P ＜0.05；*与PD 造模组比较，P ＜0.05。

组别只数TNF-αIL-1βIL-6对照组1264.55±9.567.31±0.7440.18±5.56 PD 造模组1279.32±8.51#11.27±1.40# 50.22±6.50#PD+褪黑素组1268.41±11.66*9.80±1.31* 43.50±6.07*F 4.7522.925.68 P 0.02＜0.010.01

3.讨论

PD 主要表现为锥体外系功能障碍。研究发现PD 患者黑质内多巴胺能神经元几乎完全丢失，继而使其投射至纹状体的神经纤维发生退行性变性。最终导致胆碱能通路相较多巴胺能通路的优势地位，两者平衡失衡从而引起震颤麻痹症状。PD 终晚期易造成痴呆，对患者生活状况产生极大影响。研究表明，多种机制参与了PD 的病理机制，而炎症在PD 的发病和进展中得到广泛认可。

NF-κB 是一种可调控基因表达的核转录因子[5],它通过激活反应基因的转录来激活和募集各种免疫细胞以及促进炎症介质的释放。NF-κB 还与众多疾病有比较密切的关系。许多研究发现NF-κB 的激活与PD，脑出血以及阿尔茨海默病的发病有关。有研究表明PD 患者多巴胺能神经元NF-κB 免疫反应阳性率高于正常人，达70倍以上。这提示PD 与NF-κB 激活存在较高关联。

酪氨酸羟化酶（TH）是一种限速酶，它在合成儿茶酚胺递质如多巴胺中发挥重要催化作用[6]，因此TH 活性的紊乱会在一定程度上影响PD 的发生发展。

褪黑素是一种松果体激素，它参与到PD 患者睡眠-觉醒周期的调节中[7]。研究证明PD DA 能神经元的丢失和褪黑素降低之间存在着密切的关系。阳桂春等[8]发现在褪黑素的干预下，黑质中胶质细胞的激活被显著抑制。顾超等[9]发现褪黑素可以抑制神经炎性损伤所诱导的DA 能神经元的丢失从而缓解PD。马一闻等[10]的研究表明褪黑素可抑制JAK-STATs 信号通路，从而降低促炎因子的表达，进一步加强神经保护。本文行为学实验中发现造模后的大鼠运动协调能力大幅度下降，而经褪黑素干预的大鼠在运动功能方面普遍优于PD 造模组。且褪黑素可以抑制NF-κB 信号通路，减少促炎因子表达。褪黑素可有效减少由于TH 水平降低导致的多巴胺神经元的损伤。

综上，褪黑素干预可以有效改善PD 模型大鼠的运动协调能力，且明显抑制NF-κB 信号通路激活，减少促炎细胞因子的表达，发挥其神经保护作用。因此，褪黑素可能在抑制神经炎症方面为临床治疗PD 提供新思路和方向。