小反刍兽疫免疫抗体检测与分析

赵金彩，张秀卫

（河北省赵县动物疫病预防控制中心 051530）

小反刍兽疫也称羊瘟，是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性、高度接触性传染病，主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为主要特征，潜伏期多数为4～5d，最长21d，多数羊发病10d 内死亡，急性暴发时发病率和死亡率高达100%，温和发病时发病率也很高，但死亡率一般不超过50%，自然发病仅见于山羊和绵羊。山羊发病严重，绵羊也偶有严重病例发生，幼龄动物发病严重时，发病率和死亡都很高，我国将其列为一类动物疫病。目前，该病尚无有效的治疗方法，主要预防措施是做好小反刍兽疫疫苗的免疫接种工作，国家要求所有羊只强制免疫小反刍兽疫疫苗。

为切实了解小反刍兽疫疫苗的免疫效果，科学评价小反刍兽疫抗体持续时间，我疫控中心在三个羊场采集免疫羊血清，用小反刍兽疫竞争ELISA 的方法检测小反刍兽疫抗体，对免疫结果进行评价，为今后我县羊小反刍兽疫的研究防治提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验羊场

随机选择三个羊场做实验，分别用A、B、C 场表示，3 个羊场均采用自繁自养、封闭圈舍的饲养模式。A 场存栏150 只、B 场存栏120 只，C 场存栏300 头。

1.2 疫苗接种情况

三个羊场均在2020 年10 月份免疫一次小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗，每瓶50 头份，批号2020004-1，成都华派生物工程集团有限公司生产。按照疫苗说明书，羊场兽医用25mL 灭菌生理盐水稀释疫苗，对羊场1 月龄以上的羊均进行了尾根内侧皮内注射0.5mL（1 头份），接种后羊只未出现过敏反应。

1.3 检测方法

用竞争ELISA 方法检测免疫羊血清小反刍兽疫抗体，

检测试剂盒为兰州兽研生物科技有限公司生产。

2 样品前处理

随机采集三个羊场免疫羊的全血，采集A 场血样10份，B 场10 份、C 场18 份，共38 份血样，用高速离心机分离出血清，血清清亮无溶血，对血清样品进行编号，A 场样品编号1-10 号，B 场样品编号11-20 号，C 场样品编号21-38 号。

3 实验仪器设备及试剂

3.1 仪器设备

100mL 量筒、250mL 烧杯，96 孔离心管架、1.5mL 离心管、蒸馏水、电热恒温培养箱、微型振荡器、酶标分析仪、10-100uL 和100～1000uL 单道移液器、30～300uL 的8 道移液器、不同型号的枪头、玻璃棒、贮液槽、吸水纸等。

3.2 实验试剂

试剂为兰州兽研生物科技有限公司生产的小反刍兽疫竞争ELISA 抗体检测试剂盒，批号20210609118-2，用于检测羊血清中的小反刍兽疫抗体，2℃～8℃保存。

3.3 试剂盒组成

3.3.1 已包被小反刍兽疫抗原酶标板 2 块（96 孔/块）

3.3.2 25 倍PBST 浓缩液1 瓶（60mL/瓶 ）

3.3.3 小反刍兽疫阴性对照血清1 管（500uL/管）

3.3.4 小反刍兽疫阳性对照血清1 管（500uL/管）

3.3.5 单克隆抗体工作液1 瓶 （12mL/瓶）

3.3.6 兔抗鼠酶标工作液1 瓶（12mL/瓶）

3.3.7 底物溶液（TMB）1 瓶（12mL/瓶）

3.3.8 终止液 1 瓶 （12mL/瓶）

3.3.9 封板膜2 张

3.3.10 说明书1 份

4 实验前准备

所用试剂提前2h 从冰箱取出恢复至室温，放置1h 以上，使用前充分摇匀，实验完毕后放回2℃～8℃保存。

5 操作步骤及方法

5.1 溶液配制

将25 倍浓缩液用蒸馏水做1∶25 倍稀释，配制成1 倍PBST 溶液，根据酶标板加样孔数和洗板次数，计算出1 倍PBST 溶液用量约130mL，用100mL 量筒准确量取132mL 蒸馏水加到250mL 烧杯中，用100～1000uL 移液器吸取5.5mL 25 倍浓缩液加入到盛有132mL 蒸馏水的烧杯中，用玻璃棒轻轻搅拌溶液使其均匀备用。

5.2 加样

5.2.1 取出已包被酶标板，根据加样数量，计算使用6 列酶标板即可，剩下6 列拆下放2℃～8℃保存备用。

5.2.2 对照：酶标板上依次设阴性对照血清2 孔、阳性对照血清2 孔，每孔加入相应血清50uL；空白对照孔2 孔，每孔加100uL 1 倍PBST；单克隆抗体工作液对照4 孔，每孔加50uL 1倍PBST。

5.2.3 待检样品：在待检样品孔，每孔加入待检血清样品50uL。加样顺序如下图：

5.2.4 除空白对照孔外，其他各孔加单克隆抗体工作液50uL。

5.3 加样完毕后将酶标板置于平板振荡器上轻柔振荡混匀，用封板膜封板，置于37℃温箱内温育60min。

5.4 取出酶标板甩干，用1 倍PBST 洗涤4～5 次，在吸水纸上拍干。

5.5 每孔加入兔抗鼠酶标工作液50uL。

5.6 加样完毕后，将酶标板置于平板振荡器上轻柔振荡混匀，用封板膜封板，置于37℃温箱内温育60min。

5.7 取出酶标板甩干，用1 倍PBST 洗涤4～5 次，在吸水纸上拍干。

5.8 每孔加入底物溶液50uL，置37℃避光静置反应15min。

5.9 每孔加入50uL 终止液。

5.10 用酶标仪读取酶标板OD450nm值，OD450nm值如下图：

6 判定标准

6.1 计算同一酶标板上单抗对照孔，阴、阳性血清对照孔和每份待检血清孔在450nm 波长处的平均吸光值（OD450nm），根据以下公式计算阴、阳性血清及待检血清样品的抑制率（PI值）：

PI=[1－（样品孔的OD450nm/单抗对照孔的OD450nm）]×100%。

当阴性对照孔PI ＜40%，阳性对照孔PI ＞60%时，检测结果成立，否则该次检测结果无效。

6.2 进行抗体效价评估时，待检血清PI ≥45%，抗体阳性；PI ＜40%，抗体阴性；40%＜PI ＜45%，则判定可疑。

6.3 诊断或流行病学调查时，待检血清PI ≥50%，阳性；PI ＜50%，阴性。

7 检测结果及分析

7.1 本实验阴性对照血清PI 为32.18%＜40%，阳性对照血清PI 为80.59%＞60%，本次试验检测结果有效。

7.2 检测结果：经过计算，待检血清PI 如下表：

样品编号PI（%）样品编号PI（%） 样品编号PI（%） 样品编号PI（%）173.501183.592156.433143.32 286.661280.082256.923281.86 389.641379.772364.433378.92 485.241465.052472.303440.78 576.171580.442563.363578.17 671.231674.972677.413680.39 790.171787.242755.673742.25 890.531881.412875.863857.45 983.461945.672960.79 1083.322040.033074.66

检测结果显示：样品1-19 号、21-30 号、32、33、35、36、38 号PI ＞45%， 判为抗体阳性；20、31、34、37 号40%＜PI＜45%，判为可疑。样品共38 份，抗体阳性34 份，抗体阳性率89.47%，超过了国家规定的大于70%的标准，免疫效果较好。

三个羊场检测效果：A 场样品10 份，阳性10 份，抗体阳性率100%；B 场样品10 份，阳性9 份，抗体阳性率90%，C场样品18 份，阳性15 份，抗体阳性率83.33%，三个场抗体阳性率均超过了国家规定的大于70%的标准，整体免疫效果比较好。

8 结论

通过检测三个羊场免疫羊小反刍兽疫抗体，抗体合格率均超过国家规定的大于70%的标准，抗体持续时间达到12 个月以上，整体免疫效果比较理想，说明疫苗接种是预防小反刍兽疫的有效和重要手段。今后继续推行国家要求的所有羊只强制免疫小反刍兽疫疫苗政策，做到所有羊场（包括散养户）免疫全覆盖。羊场建立健全防疫制度，消毒灭源，规范引种，坚持自繁自养、全进全出的饲养模式，采取综合防控措施，控制小反刍兽疫的发生。加强动物疫病检测机构建设，加大对羊场小反刍兽疫抗体检测力度，增加抽样检测点，对免疫结果进行科学评价，进而强化羊场措施落实，对抗体不足、免疫失败的羊场进行疫苗补免，为县域羊小反刍兽疫的研究防治提供系统技术支持。