提高畜禽产品中环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星兽残检测回收率的方法研究

刘小冬

（北京市顺义区动物疫病预防控制中心 100300）

由于环丙沙星、达氟沙星等氟喹诺酮类药物在养殖环节使用较为普遍，由此造成的耐药性问题也较突出，根据我国GB 31650—2019中的规定此四种兽药残留在肌肉组织中不得超过100μg/kg，因此在药残检测领域针对畜禽产品中四种沙星的检测也很普遍，但某些地方的农产品综合检测机构由于开展畜产品兽残检测时间较短，在开展此类兽药残留检测方法的新方法确认工作时，回收率常常不合格，但又不知如何去分析原因，影响了一些农产品质检机构的认证工作。由于使用的是添加回收的方法来测试回收率，因此提取环节对于实验回收率的影响本文不做详细探讨分析。本文重点针对实验中影响回收率很大的萃取柱净化环节进行数据记录和分析，将上样后的液体、淋洗液、洗脱液收集后进行上机检测，从而全盘分析得出回收率损失发生在何种环节，以此分析出回收率损失的原因，从而更快速有效的提升检测水平。

1 试验材料

1.1 标准品

环丙沙星（ 德国DR）、达氟沙星（ 德国DR）、恩诺沙星（德国DR）、沙拉沙星（ 德国DR）。

1.2 主要试剂

甲醇 、乙腈（ 色谱纯 JT.Baker）；磷酸 、三乙胺、磷酸二氢钾、0.03mol氢氧化钠（分析纯 北京化学试剂公司） 。

1.3 主要仪器设备

高效液相色谱仪（荧光检测器）1260 Infinity 美国Agilent

Bond ElutC18固相萃取柱100mg 3mL 美国Agilent

固相萃取装置 美国Agilent

高速冷冻离心机 韩国hanil

组织匀浆机 江苏金坛荣华仪器制造有限公司

十万分之一电子天平 OHAUS

50mL离心管 Thermo

10mL离心管 Thermo

移液器100μL/1mL/5mL/10mL eppendorf

上机小瓶2mL 美国Agilent

2 试验方法

2.1 标准储备溶液和工作液的配制

用十万分之一电子天平分别称取约25mg的环丙、达氟、恩诺、沙拉沙星标准品，用0.03mol的氢氧化钠溶解后分别配成50mL的单标储备液，并精确稀释成500μg/mL的浓度的单标储备液。将4种500μg/mL的单标储备液，各取10mL单标储备液再加10mL乙腈得到50mL浓度为100μg/mL的混标储备液。吸取100μg/mL混标储备液100μL加入9900μL的乙腈溶液后稀释液得到10mL浓度为1μg/mL的喹诺酮标准品工作液。工作液现配现用，7d内有效。

2.2 上清液制备和加标

分别称取2g空白猪肉样品加入5个50mL离心管中，加入磷酸盐缓冲液匀浆、震荡、离心。每个离心管中吸取9mL上清液共45mL上清液混匀备用。向45mL上清液中加入45μL 100μg/mL的混标储备液。得到添加浓度为100μg/kg的加标溶液。

2.3 萃取柱活化

取9根Bond ElutC18固相萃取柱（100mg 3mL）分别标注A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3。以相同条件先后用甲醇、磷酸盐缓冲液各2mL预洗。

2.4 不同流速的上样试验

将9根固相萃取柱分成三组，第一组A1、A2、A3，第二组B1、B2、B3，第三组C1、C2、C3，每个萃取柱均加入5mL加标溶液，但以不同流速进行上样，其中第一组A1、A2、A3让加标溶液以大约3～4s一滴的自然流速上样过柱，第二组B1、B2、B3用洗耳球慢速挤压使加标溶液以大约2s一滴的流速上样过柱，第三组C1、C2、C3用洗耳球快速挤压使加标溶液以大约1s一滴的流速上样过柱，用10mL离心管分别标注A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3后置于萃取柱下方，用以接收上样过柱后的溶液，上样结束后将上述离心管中溶液进行涡旋，分别取1mL注入标注为A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3的9个上机小瓶中，上机检测读取本应废弃的上样后液体的目标物的浓度，从而对比不同流速过柱后回收率的损失情况。

2.5 不同流速的淋洗试验

在9支萃取柱中分别加入1mL水以不同流速进行淋洗并挤干。其中第一组A1、A2、A3以大约3～4s一滴的自然流速淋洗过柱，第二组B1、B2、B3用洗耳球慢速挤压使加标溶液以大约2s一滴的流速淋洗过柱，第三组C1、C2、C3用洗耳球快速挤压使加标溶液以大约1s一滴的流速淋洗过柱，用10mL离心管分别编号E1、E2、E3、F1、F2、F3、G1、G2、G3后置于萃取柱下方，用以接收淋洗液，淋洗结束后将上述离心管中溶液进行涡旋，分别注入编号为E1、E2、E3、F1、F2、F3、G1、G2、G3的9个上机小瓶中，上机检测本应废弃的淋洗液中是否含有目标组分物质，从而对比不同流速淋洗对回收率损失的影响。

2.6 不同比例的洗脱液的洗脱试验

取9根固相萃取柱分别标注I1、I2、I3、J1、J2、J3、K1、K2、K3后，以相同条件，即相同的自然流速加入5mL加标溶液上样，以相同流速加入1mL水进行淋洗，分别挤干。将9根固相萃取柱分成三组，第一组I1、I2、I3，第二组J1、J2、J3，第三组K1、K2、K3，三组固相萃取柱按照不同的洗脱液比例均吸取1mL洗脱液进行洗脱并挤干，其中第一组洗脱液中磷酸/三乙胺和乙腈含量比82∶18，第二组洗脱液中磷酸/三乙胺和乙腈含量比75∶25，第三组洗脱液中磷酸/三乙胺和乙腈含量比70∶30。将编号为I1、I2、I3、J1、J2、J3、K1、K2、K3的离心管置于萃取柱下方收集洗脱液，分别涡旋过膜后注入编号I1、I2、I3、J1、J2、J3、K1、K2、K3的9个上机小瓶中，上机检测读取目标物的浓度，从而比对不同洗脱液比例对洗脱四种沙星物质的洗脱效果。

2.7 不同的洗脱体积的洗脱试验

取3根固相萃取柱分别标注L1、L2、L3后，以相同条件，即相同的自然流速加入5mL加标溶液上样，以相同流速加入1mL水进行淋洗挤干后，以相同含量的洗脱溶液（磷酸三乙胺和乙腈含量比70∶30）进行洗脱。将3根固相萃取柱用1mL洗脱液进行洗脱并挤干，收集洗脱液后分别置于编号为L1、L2、L3的上机小瓶中，上机读取目标物浓度，从而分析洗脱效果。在三根萃取柱中继续加入1mL洗脱液进行洗脱并挤干，继续收集洗脱液后分别置于编号为M1、M2、M3的上机小瓶中，上机读取目标物浓度，观察第二次1mL洗脱效果。在三根萃取柱中继续加入2mL洗脱液进行洗脱并挤干，继续收集洗脱液后分别置于编号为N1、N2、N3的上机小瓶中，上机读取四种沙星物质浓度，观察第三次2mL洗脱液的洗脱效果。

3 结果与分析

3.1 不同流速下的上样试验结果与数据分析

如表1所示。

如表1所示，以自然流速上样的A组三个平行样品上样后液体中环丙、恩诺、沙拉沙星未检测到，达氟沙星有微量损失。用洗耳球慢速挤压的B组三个平行样品上样后液体中环丙沙星和沙拉沙星未检出，达氟沙星和恩诺沙星损失变大。用洗耳球快速挤压的C组三个平行样品上样后液体中四种沙星均能检出，说明此种操作下损失最大。由此可见，上样的流速要进行适当控制不能过快，过快的流速可能妨碍了萃取柱对目标组分的吸收和拦截效率，造成目标物的损失。

3.2 不同流速的淋洗试验结果与数据分析

如表2所示，以自然流速淋洗的E组三个平行样品淋洗液中环丙、达氟、恩诺、沙拉沙星均未检出。用洗耳球慢速挤压的F组三个平行样品淋洗液中四种目标组分未检出。用洗耳球快速挤压的G 组三个平行样品淋洗液中恩诺和沙拉沙星未检出，环丙和达氟沙星有微量检出。由此可见，淋洗的流速也应当适当控制不能求快，过快的流速可能同样可能造成目标物的损失影响实验回收率。

表2 E1-G3上机检测结果 单位：μg/kg

3.3 不同比例的洗脱液的洗脱试验结果与数据分析

样品编号 环丙沙星 达氟沙星 恩诺沙星 沙拉沙星 理论值I3 49.2 50.6 42.4 32.4 50 J1 45.8 48.8 46.8 44.4 50 J2 49.4 50.2 49.4 46.0 50 J3 49.6 50.1 54 45.6 50 K1 48.6 49.8 49.6 48.4 50 K2 49.3 50.2 49.8 48.2 50 K3 49.2 50.6 50.1 50.4 50

如表3所示，I组、J组、K组中四种沙星的洗脱液浓度随着洗脱液中乙腈比例的提高而提高，证明了在洗脱液中降低水相比例增加有机相比例有助于提升洗脱效果，增加有机相比例后的洗脱液对目标物中沙拉沙星洗脱效率提升尤为明显，可以解决现实检测工作中普遍存在的沙拉沙星回收率总是偏低的问题。

表3 I1-K3上机检测结果 单位：μg/kg

3.4 不同的洗脱体积的洗脱试验与结果分析

如表4所示，L组用1mL洗脱液洗脱后的回收率在96%以上，但当第二次继续用1mL洗脱液进行洗脱后依然能收集到微量的目标物，而当第三次使用2mL洗脱液再继续洗脱时洗脱液中基本检测不到目标组分了。因此可见，按照1mL洗脱液进行洗脱可以满足回收率的要求，但如果使用两个1mL即2mL进行洗脱，则可以适当提高实验回收率。

表4 L1-N3上机检测结果 单位：μg/kg

样品编号 环丙沙星 达氟沙星 恩诺沙星 沙拉沙星 理论值N1 0 0 0 0 0 N2 0 0 0 0 0 N3 0 0 0 0 0

4 结论

本文试验了不同的实验条件下，影响氟喹诺酮兽药残留检测回收率的因素，经过比较得出如下结论：

①流速过快会损失回收率。无论是上样还是淋洗，尽量不要用洗耳球挤压，应当让过柱液体自然落下，如果流速过快，应将萃取装置的阀门进行部分关闭，控制好流速是提升回收率的关键，这样可以减少目标组分由于流速过快造成的损失。

②加大洗脱液中有机溶剂的比例可以提高洗脱效率，提高回收率。对于检测实践中沙拉沙星回收率总是偏低的问题，可以通过调整洗脱液比例为磷酸/三乙胺和乙腈含量比70∶30进行洗脱，可以显著提高沙拉沙星的回收率。

③洗脱操作可以使用1mL洗脱，也可以使用2mL洗脱回收率均在合格范围内，但2mL洗脱，回收率更高。