长期施肥对稻麦轮作紫色土有机碳组分及酶活性的影响

徐文静，张宇亭,3，魏 勇，张建伟，胡琪娟，刘 瑞，张学良，石孝均,2,3

(1.西南大学资源环境学院，重庆 400716；2.国家紫色土肥力与肥料效益监测基地，重庆 400716；3.西南大学农业科学研究院，重庆 400716)

土壤有机碳(SOC)是评价土壤质量的关键指标，土壤固碳在改良培肥土壤、提高农业生产力以及缓解全球气候变暖等方面发挥着重要作用。随着农业集约化强度增加，施肥已成为影响SOC数量和质量的重要管理措施，施肥既可能通过外源有机肥的投入或者根茬还田提高SOC含量，也可能因为激发效应降低SOC含量，从而改变土壤中有机碳的组分及与之相关的土壤酶活性。不同SOC组分间存在高度异质性，具有不同功能与性质的碳组分在SOC的稳定和积累中“各司其职”，是反映土壤质量的敏感性指标，明确不同有机碳组分的变化是了解施肥对土壤质量影响的重要手段。因此，研究长期施肥对土壤有机碳组分和土壤酶活性的影响，并寻求最佳施肥管理措施，对提升土壤质量有重要的实际指导意义。

近年来，国内外研究者对不同施肥处理下SOC组分特征开展了大量研究，已有的有机碳分组方法主要包括化学分组、物理化学分组和物理分组等，其中由Six等提出物理分组技术由于基本不改变SOC原有的性质而被广泛应用，将SOC分为3个不同概念库：未受保护有机碳库、物理保护有机碳库和化学保护有机碳库。其相关研究的结论不尽相同，总体上认为有机培肥措施能显著提高土壤总有机碳和各组分有机碳含量，尤其是大幅度提高未受保护和物理保护的有机碳组分含量。不同土壤条件、有机肥种类等对碳组分的影响存在较大差异，王晓娇等在黄土高原旱作玉米农田研究发现，有机培肥均能显著提高土壤总有机碳和各组分有机碳含量；刘小粉等研究了水稻土SOC组分对绿肥有机肥配施的响应发现，在施用有机肥的基础上配施绿肥能显著提高未受保护有机碳库组分含量；Abrar等对东北黑土研究表明，粗颗粒有机碳(cPOC)含量和大团聚体内微团聚体包裹的颗粒有机碳(i_POC)含量在单施有机肥和有机无机配施处理下显著提高，物理保护机制在土壤固碳中发挥了重要作用。此外，大量研究表明，施肥尤其是施用有机肥能直接或间接影响土壤酶活性。石丽红等研究认为，有机肥或秸秆还田配合施用化肥有利于提高土壤碳循环水解酶活性；有机肥对土壤酶活性的影响随施用量的增加而增加。前人对黄壤、红壤、黑土、水稻土等土壤类型有机碳库组分和土壤酶活性对施肥管理的响应特征已有报道，结果表明，施肥管理对农田SOC组分和土壤酶活性的影响因气候条件、作物系统和土壤类型等因素的不同存在较大的区域差异，但是关于长期施肥下紫色土碳组分特征及其与碳循环相关酶活性的研究鲜见报道。

紫色土是由紫色母岩发育形成的岩性土，集中分布于四川盆地，面积约为16万km。由于紫色土具有成土时间短、土壤固结性差、持水力弱等特点，有机质和氮缺乏已成为制约紫色土农田作物高产和土壤质量提升的主要障碍因子之一。目前关于长期施肥对紫色土有机碳的影响研究主要集中在团聚体有机碳、活性有机碳和微生物碳等方面，然而，长期施肥对稻麦轮作紫色土不同保护机制有机碳组分的影响，以及不同保护机制有机碳组分与土壤酶活性的关系等尚不明确。因此，本文以29年的稻麦轮作紫色土长期定位试验为基础，利用物理分组技术，探讨不同施肥措施下紫色土不同保护机制有机碳组分特征，测定土壤碳循环相关水解酶活性，探究长期不同施肥处理对培肥土壤、提高土壤有机碳稳定性的内在机理，为紫色土农田优化施肥和固碳增产管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在重庆市北碚区西南大学试验农场的国家紫色土肥力与肥料效益监测站(29°48′36″N，106°24′33″E)进行，为典型紫色土丘陵区，海拔266.3 m，属亚热带湿润季风气候，年均气温18.3 ℃，年降水量1 087 mm，无霜期约330天，年均日照时间1 293 h。试验地为中性紫色水稻土，初始耕层(0—20 cm)土壤基本性质为：有机质含量24.2 g/kg，全氮含量1.25 g/kg，全磷含量0.67 g/kg，碱解氮含量93 mg/kg，速效磷含量4.3 mg/kg，速效钾含量88 mg/kg，pH 7.7。

1.2 试验设计

长期试验始于1991年，主要采用小麦—水稻1年2熟的水旱轮作制。试验共设13个处理，每个处理120 m。本研究选取其中的5个处理：(1)不施肥(CK)；(2)单施氮磷钾肥(NPK)；(3)有机无机配施(NPKM)；(4)秸秆还田配施含氯化肥((NPK)S)；(5)秸秆还田配施无机肥(NPKS)。1991—1996年，化肥每季用量为150 kg/hmN，75 kg/hm磷肥(PO)，75 kg/hm钾肥(KO)。从1996年秋季起，每季PO、KO用量改为60 kg/hm；小麦N肥用量改为135 kg/hm；水稻N肥仍为150 kg/hm；有机肥每年施1次，于秋季小麦播种前作基肥施用，用量为猪粪尿22.5 t/(hm·a)、稻草7.5 t/(hm·a)(干重)。2014年之后NPKM处理有机肥使用商品有机肥，用量改为2.5 t/(hm·a)，秸秆用量改为4.5 t/(hm·a)。

1.3 测定项目与方法

土壤样品于2020年8月水稻收获后采集并测定，每个处理取4个重复，每个重复以“S”形在0—20 cm的耕层土壤中随机选定10个点进行采集，剔除植物残根，分成2份：一份土样进行冷冻干燥处理后于-20 ℃保存，用于测定土壤酶活性。剩余土样风干后用于测定各有机碳组分。

1.3.1 土壤水解酶活性测定 土壤α—葡萄糖苷酶(AG)、β—葡萄糖苷酶(BG)、β—木糖苷酶(BDX)和纤维二糖水解酶(CBH)活性采用相关试剂盒(苏州梦犀生物医药科技有限公司)测定。

1.3.2 土壤有机碳分组 土壤有机碳分组采用物理分组方法，将土壤有机碳分为3个碳库，即未受保护有机碳(cPOC、M_POC、f_POC)、物理保护有机碳(i_POC、m_POC)和化学保护有机碳(f_s+c、M_s+c、i_s+c、m_s+c)，分组程序见图1。

图1 物理分组流程

土壤物理分组方法具体流程：称取50 g土壤，首先将过8 mm筛的风干土湿筛，获取3个组分，即受化学保护的游离粉黏粒有机碳(f_s+c)，>0.25 mm和0.053～0.25 mm组分；再将>0.25 mm组分进行微团聚体分散，在0.25 mm筛上放置直径为4 mm的玻璃珠50颗，淹水浸泡5 min，并下置0.053 mm筛，在恒定水流冲刷下振荡过筛，得到未受保护的粗颗粒有机碳(cPOC)、受化学保护的大团聚体包裹的粉黏粒有机碳(M_s+c)和大团聚体包裹的微团聚体3个组分；其次将第1步得到的0.053～0.25 mm组分和大团聚体包裹的微团聚体组分进行密度浮选，得到未受保护的大团聚体包裹的细颗粒有机碳(M_POC)和游离的细颗粒有机碳(f_POC)，再将重组经过六偏磷酸钠分散过0.053 mm筛，得到受物理保护的大团聚体内微团聚体包裹的颗粒有机碳(i_POC)和微团聚体包裹的颗粒有机碳(m_POC)，同时得到受化学保护的大团聚体内微团聚体包裹的粉黏粒有机碳(i_s+c)和微团聚体包裹的粉黏粒有机碳(m_s+c)。本试验中由于M_POC、f_POC组分所得量少，所以与cPOC组分一起测定。

采用重铬酸钾—浓硫酸外加热法测定全土以及各有机质组分中的有机碳含量。各个组分的质量以及有机碳含量的结果用于有机质组分含量、有机质含量及分配比例的计算，其计算公式为：

(g/kg)=×

(%)=/SOC×100%

式中：为各组分有机碳在全土中的含量(g/kg)；为各组分有机碳浓度(g/kg)；为该组分的质量分数(g/g)；为各组分有机碳的分配比例(%)；SOC为全土有机碳含量(g/kg)。

1.4 数据处理

利用Microsoft Excel 2010和SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。采用单因素方差分析对处理间差异进行显著性检验，显著水平为0.05，用LSD法进行多重比较。用线性函数对总有机碳含量与各组分有机碳含量的关系进行拟合。用Pearson的双侧检验法对不同保护机制有机碳组分与碳循环相关酶活性进行相关性分析。利用Origin 2018绘图软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 长期不同施肥处理土壤总有机碳含量特征

由试验结果可知，CK、NPK、NPKM、(NPK)S和NPKS处理土壤总有机碳含量分别为12.47，14.74，15.14，13.91，17.48 g/kg，呈现出NPKS>NPKM≈NPK>(NPK)S>CK的规律，各施肥处理土壤总有机碳含量较CK处理均有显著提高(<0.05)，提升幅度为11.6%～40.2%，其中NPKS处理对土壤总有机碳含量提升效果最大，其次为NPKM、NPK处理，(NPK)S处理对总有机碳含量的提升幅度最小。

2.2 长期不同施肥处理土壤有机碳不同组分含量特征

由表1可知，紫色土三大碳库有机碳含量所有处理均为化学保护有机碳>未受保护有机碳>物理保护有机碳含量，其中化学保护、未受保护有机碳比物理保护有机碳平均含量分别提高7.3，2.8倍。不同施肥处理对土壤有机碳库组分影响显著，NPK、NPKM和NPKS处理均显著提高未受保护有机碳cPOC含量，与CK处理相比，分别提高32.3%，58.5%和76.3%，其中NPKM和NPKS处理优于NPK处理；但(NPK)S处理较CK处理无显著差异。

物理保护有机碳库各组分有机碳含量在长期不同施肥处理下也表现出明显差异(表1)。施肥29年后i_POC含量显著高于CK处理，各施肥处理i_POC含量提升19.5%～64.9%，其中NPKS处理下i_POC含量提升最显著；秸秆还田的(NPK)S和NPKS处理显著提高m_POC含量(<0.05)，与CK处理相比，分别提高44.6%和65.1%，而NPK和NPKM处理与CK处理相比m_POC含量无显著变化。

表1 长期施肥下土壤各组分有机碳含量 单位:g/kg

化学保护碳库的4个组分中，以i_s+c组分碳含量最高，其次是M_s+c，f_s+c碳含量最低。长期不同施肥对化学保护碳库各组分有机碳含量也有不同程度的影响。较CK处理，NPK和NPKM处理f_s+c含量显著降低，分别降低12.7%和19.1%，而(NPK)S和NPKS处理f_s+c含量较CK处理无显著变化；M_s+c和i_s+c含量在长期不同施肥后较CK处理均有显著提高，NPK、NPKM、(NPK)S和NPKS处理M_s+c和i_s+c含量分别提高16.9%，26.6%，23.0%，33.2%和32.7%，24.6%，25.8%，38.2%，均以NPKS处理提升效果最佳；与CK处理相比，NPK和NPKS处理下m_s+c含量显著提高，分别为1.38，1.24 g/kg，增加51.5%和36.9%，NPKM和(NPK)S处理m_s+c含量较CK处理无显著差异。可见，长期施肥会引起土壤各有机碳库组分含量的变化，与对照相比，未受保护有机碳库和物理保护有机碳库组分含量的提升幅度大于化学保护有机碳库组分含量。

2.3 长期不同施肥处理土壤有机碳组分与总有机碳含量的关系

图2相关分析结果表明，长期不同施肥下土壤中cPOC、i_POC和M_s+c与总有机碳含量呈显著正相关关系(<0.05)，方程斜率的高低反映各组分碳随总有机碳的变化大小。由方程斜率可知，总有机碳变化引起的cPOC变化率最高，其次是i_s+c；方程的斜率表明，总有机碳含量每提升1个单位(g/kg)，其中有40%(即0.4个单位的碳)成为cPOC组分，21%成为i_s+c组分，11%成为M_s+c组分，8%成为i_POC组分，还有20%成为m_POC、f_s+c和m_s+c组分。

图2 长期施肥下土壤总有机碳含量与各组分有机碳含量的相关性

2.4 长期施肥下土壤有机碳组分分配比例

从图3可以看出，土壤各有机碳组分占总有机碳的比例在长期不同施肥处理下存在显著差异。各施肥处理的土壤化学保护有机碳库所占比例为61.9%～70.9%，是总有机碳库中占比最高的组分；其次为未受保护有机碳(19.9%～28.9%)，物理保护有机碳库所占比例最低，为8.3%～9.4%。土壤化学保护有机碳的分配比例是其他组分的2～9倍。可见，土壤化学保护有机碳是土壤中有机碳的主要储存组分。与CK处理相比，NPKM和NPKS处理显著增加了未受保护和物理保护有机碳库所占比例，未受保护有机碳库所占比例分别增加24.1%和21.3%，物理保护有机碳库所占比例分别增加10.1%和13.3%；但同时也显著降低化学保护碳库所占比例，分别降低9.5%和8.9%；较CK处理，NPK处理的各有机碳组分分配比例均无显著差异；而(NPK)S处理的未受保护有机碳分配比例显著降低，降幅为14.8%，物理保护有机碳和化学保护有机碳分配比例分别显著提高，增幅分别为10.6%和3.7%。

图3 长期施肥下土壤各有机碳组分占总有机碳的比例

2.5 长期施肥下土壤水解酶活性特征

由表2可知，长期不同施肥处理对土壤碳循环相关水解酶活性有较大的影响。经过29年长期施肥后，NPK、NPKM和NPKS处理下的AG、BG和BDX活性较CK处理均显著提高(<0.05)，NPK、NPKM和NPKS处理的土壤AG活性分别提高13.2%，33.5%和30.7%，BG活性分别提高14.8%，17.2%和15.4%，BDX活性分别提高33.2%，49.2%和89.1%，均以NPKM和NPKS处理提升效果为最佳；而NPK、NPKM、NPKS处理的CBH活性较CK处理无显著差异。可见，NPK、NPKM和NPKS处理间除CBH外的其余3种碳循环相关水解酶活性的变化趋势较为一致。此外，与CK处理相比较，(NPK)S处理的CBH活性显著降低，降幅为18.5%，而其余3种水解酶活性较CK处理均无显著差异。

表2 长期施肥下土壤水解酶活性 单位：μmol/(d·g)

2.6 土壤水解酶活性与有机碳组分相关性分析

表3相关分析结果显示，未受保护有机碳与AG、BG和BDX活性的相关性呈显著或极显著正相关，与CBH活性的相关性未达显著水平；物理保护有机碳与BDX活性的相关性呈显著正相关，与碳循环其余3种酶活性的相关性均未达显著水平；化学保护有机碳与AG、BG、BDX和CBH活性的相关性均未达显著水平。

表3 土壤水解酶与碳组分的相关分析

3 讨 论

3.1 长期施肥对土壤总有机碳含量的影响

SOC含量主要受有机物质的外源输入、作物生物量、根系分泌物和微生物活性等影响。本试验结果表明，29年长期施肥后NPK、NPKM、(NPK)S和NPKS处理的土壤总有机碳含量较CK处理均有显著提高，其中NPKS处理最佳。施用化肥NPK提高土壤有机碳，主要原因是为作物提供所需的养分，从而提高作物产量，作物根茬和枯枝落叶来源的有机碳投入增加；有机肥与化肥配施的NPKM和NPKS处理通过大量外源有机物质的输入，从而提高有机碳含量，表明在现有的试验条件下紫色土发挥了碳汇作用。毛霞丽等关于长期施肥对浙江稻田土壤有机碳的影响研究表明，有机无机配施处理较单施化肥处理对土壤有机碳的提升作用效果更佳，与本文研究结果基本吻合；安永齐对不同培肥方式下土壤有机质提升效应的研究也得到相同结论。本研究还发现，尽管(NPK)S处理也进行秸秆还田，但该处理下土壤总有机碳含量的提升幅度最小，其原因可能是含氯化肥的长期施用引起土壤酸化，导致土壤生物肥力下降，影响微生物群落和降低土壤酶活性，使SOC的分解转化作用减弱，因而土壤总有机碳含量提升幅度较小。因此本试验条件下NPKS处理为提升土壤总有机碳含量的最佳施肥措施。

3.2 长期施肥对土壤有机碳组分的影响

根据Six等提出的概念模型，未受保护有机碳库主要来自植物残渣，易被侵蚀消耗，也易因外源有机碳的补充而变化。本研究中，除(NPK)S处理，其余施肥处理较CK处理均显著增加cPOC含量，NPKM和NPKS处理较CK处理显著增加未受保护有机碳库分配比例，且cPOC组分随着总有机碳含量的提升表现出显著的增加趋势。与其他组分相比，cPOC的变化率最高，研究结果表明，未受保护有机碳组分是土壤新增有机碳的主要固存组分，cPOC可作为长期不同施肥下紫色土土壤质量变化的敏感指标。Tian等的相关研究表明，有机无机肥配合施用不仅显著增加cPOC含量，还增加未受保护有机碳库的分配比例，与本文研究结果一致。各施肥处理尤其是有机无机配施处理增加作物地上部和地下部生物量，导致更多的作物残茬和根系分泌归还到土壤中，而秸秆还田处理直接输入植物残渣，显著增加cPOC含量，以及提高未受保护有机碳的分配比例。

i_POC和m_POC组分是土壤团聚体的包裹碳，属于物理保护有机碳库。本研究中，各施肥处理均显著提高i_POC含量，(NPK)S和NPKS处理显著提高m_POC含量，NPKM、(NPK)S和NPKS处理也显著提高物理保护有机碳库分配比例。谢钧宇对塿土的相关研究中也得出一致的结果，即施用有机肥能显著提高i_POC含量。其主要原因可能是根茬归还和有机肥的施用能提供团聚作用所需的胶结物质，促进团聚体的形成和团聚体有机碳的累积；也能提高土壤生物活性，增加对大团聚体和微团聚体的形成具有重要作用的真菌和细菌比例，间接使土壤中的团聚体结构得到改善，增加土壤有机碳的物理保护作用，因此，有机无机配施条件下i_POC和m_POC含量提升幅度高于其他碳组分，物理保护有机碳的分配比例也显著提高。

化学保护有机碳是指高价铁铝氧化物和黏土矿物通过配位体置换等作用产生的有机碳固存，属于矿物结合态有机碳；本研究中，较不施肥处理，各施肥处理均显著提高土壤中M_s+c和i_s+c组分有机碳含量，但NPKM和NPKS处理均显著降低化学保护有机碳库的分配比例。安永齐研究发现，5年覆土复垦土壤中化学保护有机碳组分在各施肥处理间均无显著差异，与本试验研究结果并不一致。这主要是因为通过有机肥施用等途径输入的外源碳先分解转化为未受保护和物理保护有机碳，经过长时间的作用后才能转化为腐殖化程度较高的矿物结合有机碳，本试验布置长达29年，有充足的时间完成向矿物结合有机碳的转变，因此不同施肥能显著提高化学保护有机碳组分含量。另外，本试验中NPKM和NPKS处理化学保护有机碳库分配比例显著下降，可能是因为当季所施化肥和有机肥大幅度地提升未受保护和物理保护有机碳库占比，导致化学保护有机碳组分碳库占比相对降低。

3.3 长期施肥对土壤水解酶活性的影响

土壤水解酶是土壤生态系统养分循环和代谢的主要驱动力，水解酶活性反映土壤的生物活性和生化反应的活跃程度。土壤水解酶活性对土壤环境因素敏感，不同研究者在不同区域和土壤上的研究结果存在较大差异。杜林森等的研究表明，土壤BG活性在各施肥处理中表现出施化肥高于不施肥，秸秆还田高于单施化肥的趋势；夏文建等通过研究红壤双季稻田土壤水解酶活性在长期施肥下的变化特征发现，长期施用化肥或有机无机配施提高稻田土壤碳循环相关的AG、BG活性，与本试验研究结果相吻合。本研究表明，长期施肥条件下，NPK、NPKM和NPKS处理较CK处理显著提高AG、BG和BDX活性，且NPKM和NPKS对酶活性提高效果更佳，主要原因是为微生物提供了丰富的碳源，刺激微生物生长，提高酶活性；同时有机肥的施用改善土壤物理与化学性质，为微生物的生长提供一个良好的环境，进一步提高酶活性；且有机肥自身也携带丰富的酶类。本研究还发现，(NPK)S处理显著降低CBH活性，且该处理其余3种水解酶活性较CK处理均无显著差异，可能是因为长期施用含氯化肥降低土壤的pH，从而影响土壤生境对微生物的适宜性，降低酶活性。

3.4 土壤水解酶活性与有机碳组分的关系

研究土壤不同有机碳组分与酶活性之间的相关性，可进一步从生物学角度探究土壤有机碳转化与土壤碳循环相关水解酶间的相互作用。本试验结果表明，未受保护有机碳与AG、BG和BDX活性的相关性呈显著或极显著正相关，物理保护有机碳与BDX活性的相关性呈显著正相关，但化学保护有机碳与碳循环相关水解酶活性的相关性未达显著水平，这可能与不同碳组分的物质组成与微生物对碳的利用效率及其产生的酶活性有关。未受保护有机碳属于高活性有机碳组分，主要是淀粉、可溶性糖类、纤维素、半纤维素等成分，容易被微生物利用，酶活性增加；AG、BG和BDX对土壤纤维素的分解及可溶性糖类的形成起重要作用，因此未受保护有机碳组分与AG、BG和BDX活性呈显著正相关；物理保护有机碳库中不同级别团聚体对SOC的保护程度也不尽相同，大团聚体内微团聚体(i_POC)不稳定，是活性有机碳库的一部分，易被微生物和酶接触分解，周转快，因此与部分碳循环相关水解酶(BDX)活性呈正相关。而化学保护有机碳属于惰性矿物结合态有机碳范畴，是有机物分解的最终产物与土壤黏粒和粉粒结合的部分，稳定性强，难以被微生物和酶接触分解，与碳循环相关水解酶活性的相关性差。说明长期施肥使得土壤未受保护和物理保护有机碳组分含量增加，从而刺激微生物活动，增加土壤碳循环相关水解酶活性；而酶活性的提高有利于加强土壤中碳循环强度，促进有机碳的分解和合成，对保持土壤有机碳的活性、维持土壤肥力质量有重要意义。

4 结 论

(1)长期施肥(NPK、NPKM和NPKS)有利于提高土壤总有机碳和不同组分有机碳(cPOC、i_POC、M_s+c和i_s+c)含量，以NPKM和NPKS处理提升作用最大。

(2)cPOC有机碳组分对土壤碳库变化的响应最敏感，土壤有机碳每提升1个单位，其中有40%的碳保存于未受保护有机碳库cPOC组分中。化学保护有机碳库是紫色土有机碳的主要固存组分，平均占土壤总碳的66.1%，NPKM和NPKS处理显著提高未受保护和物理保护有机碳库占总有机碳的比例。

(3)施肥显著提高土壤碳循环水解酶(AG、BG和BDX)活性，水解酶(AG、BG和BDX)与土壤未受保护有机碳均呈显著正相关。