碳纳米管对生态系统的毒性研究进展1

申惠娟，韩太坤，邓锂强，赖国霞，祁玲敏，宁土荣

(广东石油化工学院 理学院，广东 茂名 525000)

纳米材料为至少一维方向上的尺度在1～100 nm范围内的材料，由于其独特的物理结构，已在机械力学、电学、光学以及生物医学等领域被广泛应用。由于碳纳米管具有比表面积大、抗拉伸能力强、耐高温及导电性能好等优点，被广泛应用于环境检测及生物医药等领域[1，2]。与众多其他纳米材料类似，其小尺寸与大的比表面积可以使其发挥出独特的化学特性，如可以作为催化剂或用于治疗功能的靶向药物运载，但治疗的同时，也会诱导周围其他组织产生氧化应激，甚至损坏细胞功能[3]。早在2009 年，美国和欧盟已经分别加强了对碳纳米管的应用与管理的控制[4]。因此，关于碳纳米管可能带来的潜在健康危害也在被广泛研究。碳纳米管的毒性与许多因素有关，如单壁碳纳米管的毒性会随其功能化和表面活性剂浓度以及碳纳米管的理化性质(如结构、直径、金属含量)不同而异[5]；多壁碳纳米管的生物毒性则与其长度、形状和硬度等物性参数有关[6]；有研究表明，同样条件下，不同层数碳纳米管的生物毒性大小顺序为：单壁碳纳米管 > 双壁碳纳米管 > 多壁碳纳米管[7]。随着碳纳米管在各个领域的应用，人们在研究和制备碳纳米管的过程中，就会暴露在碳纳米管氛围中，通过皮肤或呼吸道等，增加碳纳米管进入体内的机会[8]。而随着碳纳米管的相关下游产品的大量涌入市场，进入到生活及各种应用领域后，碳纳米管将会扩展到整个生态系统包括动物、植物及水体等。因此，研究碳纳米管的生物毒性及其与不同生物种类的相互作用机理，对于合理利用和有效监管碳纳米管的应用具有重要的意义。到目前为止，针对碳纳米管材料的毒性研究资料尚不够充足，缺乏更多实验数据与细节的支撑[9]，本文总结了近几年关于碳纳米管在该领域的最新研究进展，以期为进一步推动相关工作的进程提供重要参考。

1 碳纳米管对人体及动物组织的毒性研究

碳纳米管由于独特的物理化学性质，可以携带多种分子透过细胞膜进入体内。多项研究已经表明，碳纳米管可以迅速分布到肝、脑、心脏、肾、肺、脾、胃等多个器官组织，并引起器官组织损伤，造成生殖毒性、遗传毒性、肝肾功能减退等各种病变[10-14]。

丁世平等[15]研究了聚乙二醇改性多壁碳纳米管对人胚肾细胞和人肝癌细胞的体外细胞毒性。在作用24 h后，随着碳纳米管的质量浓度从0增加到200 μg/mL，人胚肾细胞的形貌发生了明显改变，坏死细胞的数量明显增加；当碳纳米管的质量浓度高于12.5 μg/mL 时，细胞的存活率随碳纳米管浓度的增加而降低。同样，碳纳米管对人体肝细胞形貌及细胞存活率的影响与人胚肾细胞类似，而该碳纳米管对两种细胞的毒性对时间的依赖性体现得并不明显。进一步通过流式细胞术(FCM)分析了细胞的存活性与碳纳米管浓度的关系，证明碳纳米管的毒性质量浓度范围为100～200 μg/mL，并根据ISO2109932-5毒性标准，表明该碳纳米管在该范围内的毒性等级为II级，即具有轻微毒性。

赵琢等[13,14]研究了单壁碳纳米管和多壁碳纳米管对人体肝细胞HepG2的致毒性。结果显示，随着浓度的增加，单壁碳纳米管对人体肝细胞HepG2的增殖抑制作用更强；同时，延长碳纳米管的作用时间对该肝细胞的抑制效果更明显。在研究单壁碳纳米管对肝的代谢能力及相关代谢酶的影响时发现，经单壁碳纳米管处理后，肝细胞HepG2中的几种重要的肝代谢酶包括CYP1A1、GSTP1和COMT的表达能力明显降低。分析认为，降低的原因有可能来自实验中的SWCNT导致体内雌激素积累；而另一方面，这几种代谢酶表达水平的降低，同时也削弱了肝细胞的毒性代谢能力，从而使碳纳米管对肝细胞的损伤程度加重。同样的效果也表现在多壁碳纳米管对人体肝细胞HepG2的毒性研究中。随着多壁碳纳米管浓度与作用时间的增加，人体肝细胞HepG2的存活率明显下降。而且，多壁碳纳米管对肝代谢酶CYP1A1和GSTP1的影响显示，随着多壁碳纳米管浓度增加，肝代谢酶CYP1A1的蛋白含量与表达水平逐渐降低；然而，与单壁碳纳米管不同的是，多壁碳纳米管浓度增加后，另一种肝代谢酶GSTP1的表达水平和蛋白含量得到了明显提高。由于肝代谢酶GSTP1是致癌细胞代谢酶中重要的成员之一，负责毒性物质的代谢及解毒，因此，该结果表明，多壁碳纳米管存在于人体肝细胞HepG2中时，可以诱导肝代谢酶GSTP1的表达，增强肝细胞的排毒功能，从而降低多壁碳纳米管对肝脏的毒性作用。

谢雪平等[16]研究了静脉注射羧基化单壁碳纳米管对大鼠肾脏的毒性作用。分别静脉注射羧基化单壁碳纳米管葡萄糖溶液30～90 d，以30 d为间隔进行测试。结果显示，30 d后，大鼠的肾小球、细胞核和线粒体发生明显变化；与未注射的对比，注射后的大鼠出现肾脏血管壁增厚，管腔扩张及纤维组织增生等现象；连续染毒90 d后注射组的大鼠肾脏验证和纤维化程度最严重，但停止染毒30 d后，症状可以缓解。由此可见，长期静脉注射羧基化单壁碳纳米管会损伤大鼠的肾脏，引发肾脏发生炎症反应和肾纤维化。

2 碳纳米管对水体动物的毒性病理研究

大多数对碳纳米管的毒性研究对象主要集中于淡水生物，而对海洋生物的毒性研究较少。杨占宁等[17]以太平洋牡蛎为实验对象，研究了单壁碳纳米管对海洋生物的毒性。首先对照鳃和消化腺的氧化损伤程度显示，在暴露于单壁碳纳米管中96 h后，鳃和消化腺的抗氧化酶活性均显著升高，且随着碳纳米管浓度的升高而增大。继而研究两种组织中MDA含量的变化情况发现，在暴露96 h后，两种组织中的MDA含量均出现明显增加，且消化腺中的MDA含量随碳纳米管浓度的增加而增大，另一方面，鳃则即使在低质量浓度下(0.1 mg/L)，其MDA含量仍明显高于对照组，表明鳃相对于消化腺更容易受到损伤。

目前，碳纳米管对水生物的毒性研究大多来自欧美等国家，因此研究对象主要以水蚤和斑马鱼等为主，而我国在这方面的研究则以普遍存在的鲫鱼或鲤鱼为研究对象。如阚海峰等[18]研究了单壁碳纳米管和羟基化多壁碳纳米管对锦鲫抗氧化防御系统的影响。分别将锦鲫暴露在不同浓度的单壁碳纳米管和羟基化多壁碳纳米管环境中14 d后，发现两种不同浓度的碳纳米管均对锦鲫鱼鳃造成了损伤。其中，暴露在低质量浓度下(10 μg /L)的鱼鳃会出现鳃丝膨胀肿大；高质量浓度下(1000 μg /L)的鱼鳃则出现鳃动脉瘤和鳃细胞水肿等使鱼鳃完全丧失功能。在对锦鲫的肝脏染毒14 d后，高浓度下的单壁碳纳米管和羟基化多壁碳纳米管仅引起肝细胞炎症等轻微损伤，低浓度下则未对肝细胞造成损伤。主要原因可能是鱼鳃在呼吸过程中过滤大量的水，导致该部位更容易受到碳纳米管的毒性侵染。通过研究两种纳米管对锦鲫抗氧化防御系统的影响发现，在暴露初期(7 d)，抗氧化酶SOD活性均增强，高浓度的单壁碳纳米管对CAT产生抑制作用，而羟基化多壁碳纳米管对CAT产生显著诱导作用；14 d后，高浓度单壁碳纳米管对SOD 产生抑制作用，而羟基化多壁碳纳米管则使SOD酶活性提高，且单壁碳纳米管对CAT产生了诱导作用；经过28 d后，各浓度下的两种碳纳米管对SOD酶和CAT酶产生了显著抑制，导致肝脏受损。可见，碳纳米管的暴露会使鱼体产生氧化应激，增加了锦鲫体内活性氧的积累，大量的活性氧会消耗体内的抗氧化酶，从而损伤锦鲫组织。

以两栖动物为测试对象研究碳纳米管的毒性目前也相对较少，赵建彬等[19]以两栖动物热带爪蛙为实验对象，研究不同浓度多壁碳纳米管在爪蛙不同生长阶段的毒性效应。首先通过多壁碳纳米管对爪蛙胚胎进行急性毒性实验。研究表明，经过96 h后，与对照组相比，不同质量浓度(25， 50 mg/L)的碳纳米管均对爪蛙胚胎的存活率造成了显著的影响。在较高质量浓度(50 mg/L)下，不同时期的胚胎死亡率最高位为8.96%，表明多壁碳纳米管对早期的爪蛙胚胎急性毒性较低。高浓度下的多壁碳纳米管对胚胎孵化率、畸形率的影响较低浓度的明显，而两种浓度下对胚胎的心率和体长的影响与对照组相差不大。在爪蛙的蝌蚪阶段，随着多壁碳纳米管暴露时间的增加，蝌蚪的死亡率先增高后下降。进一步研究多壁碳纳米管在蝌蚪体内的富集部位发现，经过72 h暴露后，碳纳米管主要集中在蝌蚪的肠、胃和鳃部位，而且浓度较高下的碳纳米管更容易集中于鳃。后期将其置于清水中恢复4 d，低质量浓度下(0.5 mg/L)的蝌蚪只有43.3%恢复健康，而高浓度下的蝌蚪全部死亡，可见多壁碳纳米管在体内的富集会导致不可逆的损伤。在爪蛙成年阶段，研究显示多壁碳纳米管对爪蛙的体重增长具有一定的抑制作用，并且减少体内精原细胞和卵原细胞的数量。通过对遗传毒性的研究表明，暴露于碳纳米管颗粒环境中的爪蛙受精率明显降低，且已受精后的胚胎存活率也会下降，可见碳纳米管对爪蛙存在一定的生殖毒性。

3 碳纳米管对植物的毒性研究

碳纳米管的纳米尺寸使其极易被植物吸收，碳纳米管通过植物的根系吸附在植物表面，并逐渐与植物的细胞膜结合；或者直接穿透植物的细胞膜进入细胞内部。目前关于碳纳米管对植物的影响研究中，既有促进作用，也有毒性作用，取决于碳纳米管与植物细胞的作用机制。如赛闹等[20]研究了多壁碳纳米管对水稻幼苗的生理学效应，研究显示，不同外管径的多壁碳纳米管处理后的水稻经过10 d后，管径小于8 nm的多壁碳纳米管处理后的水稻，与对照组相比，根系可溶性蛋白和可溶性根系含糖量有所降低；而管径大于20 nm的多壁碳纳米管，两者均表现出明显升高，尤其是管径大于50 nm的碳纳米管处理后的水稻，长势明显优于前两者，且根系的抗氧化酶活性明显提高，而外径小于8 nm 的碳纳米管处理后的水稻根茎，在10 d后的相比于其他两组的氧产生率最高。随着碳纳米管外径的增加，处理后的水稻幼苗叶绿素含量也逐渐增加。进一步研究多壁碳纳米管在对缓解1,2,4-三氯苯(TCB)对水稻幼苗的生理学胁迫过程中的作用发现，多壁碳纳米管与TCB的协同作用可以缓解水稻幼苗的失绿与萎蔫，而对其他因素无法起到显著的改善作用。由此可见，碳纳米管作用于水稻幼苗，可以促进水稻的生长，并增加水稻幼苗的成活率。

我国土壤重金属污染形势严峻，其中镉点位超标率达到7%[21]，导致大面积水稻种植土壤出现“缺磷”现象，并影响稻米的质量安全。杨思楠等[22]利用碳纳米管较强的吸附能力，分析了单一多壁碳纳米管及其与镉离子复合处理后的水稻生长状况。结果显示，培养20 d后，与对照组相比，单一碳纳米管处理过的水稻幼苗根系活力随碳纳米管浓度的升高呈现出明显的下降趋势，最大下降率为69.6%。同样，与镉离子复合的碳纳米管浓度越高，水稻幼苗活力下降程度越大，且比单一处理组下降率最大高出24.4%，可见复合处理组对水稻幼苗的损伤度更高。而且，与镉离子复合的碳纳米管对水稻幼苗叶绿素的降低程度也明显高于单一碳纳米管的作用。同时，与对照组相比，单一处理组和复合处理组对水稻幼苗的过氧化酶活性及光合作用能力的影响均具有不同程度增加，其中复合处理组使过氧化酶活性提高幅度最大，对光合作用能力的影响也最为明显，表明与镉离子复合的碳纳米管对幼苗生长产生的负面影响最高。

与本征多壁碳纳米管相比，羧基化多壁碳纳米管具有更好的分散性和亲水性。但其对重金属离子的吸附性更强，会促进重金属离子渗入到植物细胞，从而影响植物生长。刘玲等[23]对羧基化多壁碳纳米管及其与镉离子复合后对水稻幼苗叶片的毒性进行了分析。结果显示，相同质量浓度下，羧基化多壁碳纳米管与镉离子复合物对水稻幼苗处理后，其叶片的叶绿素含量和抗氧化酶均低于单一处理组，而MDA 和阳离子产生率均高于单一对照组。表明羧基化多壁碳纳米管与镉离子复合会加剧对水稻幼苗的损伤，应尽量避免。

4 结语与展望

已有的研究表明，碳纳米管被广泛应用到生产和生活中的同时，会给动植物甚至人体带来不同程度的毒性隐患，应加强对这方面的研究。从目前的研究进展可看出该领域还存在诸多空缺需进一步加强。首先，碳纳米管的毒性与纳米管本身的诸多因素有关，包括物性参数及合成过程等，而大多数研究对相关细节的描述不够全面和具体，对碳纳米管的毒性机理研究方面的工作还很欠缺，这与作用过程复杂且表征困难有关，需要进一步完善各方面的表征测试，有助于更好地分析其作用机理；其次，研究对象只局限于有代表性的动物或植物实验体，应该开展更广泛的研究，丰富研究种类和实验数据，使碳纳米管的毒性效应得到更多人的重视；最后，研究内容的系统性欠缺。如单壁碳纳米管存在于人体肝细胞时，会抑制代谢酶GSTP1的表达，使排毒功能减弱；而多壁碳纳米管则相反，可以起到增强肝细胞的排毒功能的效果。因此，单一地研究碳纳米管的正面作用或者负面作用，而没有将两者有机结合起来，使碳纳米管在很好地发挥正面作用的同时，也能有效缓解或适当控制其产生的负面影响，从而促进碳纳米管更好地应用到生产和生活中。总之，关于碳纳米管的毒性研究还需要更多技术和数据支撑，才能使该研究更加系统化和科学化。