竹子基因资源和应用技术研究进展

徐丹丹，李新林，邓伟芬，蒋思媛，任慧敏， 王安可，杜旭华，柳参奎，亓果宁*

(1.浙江农林大学 林业与生物技术学院 亚热带森林培育国家重点实验室，浙江 杭州 311300； 2.龙泉市林业事务中心，浙江 丽水 323700； 3.国家林业和草原局竹子研究开发中心，浙江 杭州 310012)

竹子是多年生禾本科(Gramineae)竹亚科(Bambusoideae)植物，世界上拥有80多属1 600多种竹类植物，多生长在气候温暖湿润的地区。当前世界竹林面积约2 200万hm2，而我国拥有其中四分之一左右的竹林面积[1]，因此竹类植物在我国素有“第二森林”之称。竹子作为我国最重要的经济林木之一，具有生长快、产量高、用途广等特点。竹林还具有很强的固碳能力，能稳定大气中二氧化碳含量，是我国碳中和的重要载体[2]，竹子因此具有重要的经济价值和生态价值。但是在竹子研究生产的过程中发现竹子开花发育不稳定，导致其遗传改良进展缓慢。目前在众多竹种中，只有毛竹(Phyllostachysedulis)和麻竹(Dendrocalamuslatiflorus)公布了染色体级别的基因组图谱[2-3]，其余竹种的基因组仍在开拓研究中，加之竹子遗传转化体系的建立十分缓慢，很大程度上限制了竹子种质资源的创新。

近年来，国内外许多学者在竹子基因组、再生和转化体系等方面进行了深入研究，并取得了一定的进展，基于此，该文对竹子基因组、功能基因、组织培养、遗传转化和应用前景等进行综述，总结了目前研究存在的问题，并提出可能的解决方案，为现代竹子种质创新提供参考。

1 竹子组学研究进展和关键功能基因的挖掘

1.1 竹子组学研究进展

基于竹子重要的经济效益和生态效益，通过组学方法解析其生物学特性的研究结果也在日益增加。2013年Peng Z H等完成了对毛竹的基因组测序，该测序结果公开了1个高质量的毛竹基因组序列草图，2.05-Gb的基因集覆盖了95 %的基因组区，95%以上区域的高质量序列由毛竹基因组150倍覆盖率的原始序列组装，组装scoffolds N50长度超过328 kb，其中包含32 000个约占毛竹基因总数90%的基因[3]。2017年，Zhao H S等启动了竹和藤基因组图谱(Genome Atlas of Bamboo and Rattan，GABR)项目，GABR的核心项目之一是Bamboo-T1K(1 000种竹子的转录组)，通过采集不同国家不同区域的竹子和藤样本并对其进行测序，最终生成了大规模的组学数据，以此推动基础分子生物学研究到应用基因工程的竹藤基因组研究。截止目前已经采集了从马来西亚、加纳、肯尼亚、埃塞俄比亚、巴西和中国的许多地方约340种竹子和2种藤样本。其中有超过300种竹子和2种藤将被测序[4]。Zhao H S等在2018年将毛竹基因组完善至高精度的染色体水平，提供了毛竹染色体水平的从头基因组组装scoffolds N50长度达到79.90 Mb，约为之前版本的243倍的基因组数据。除此之外，还鉴定出51 074个结构完整的高质量蛋白质编码位点。在对26个具有代表性的竹子组织进行转录组测序后，发现在25 225个选择性剪接(Alternative Splicing，AS)基因中鉴定了266 711个独特的AS事件，从而提供了1个全面的AS图谱。研究发现，在竹类植物中，AS作为1个重要的生物过程，AS基因集中在更保守的基因中，这些基因具有更高的转录水平，组织特异性差异较大[5]。在2021年，Zhao H S等从覆盖15个代表性地理区域的427毛竹个体的全基因组重测序中获得545万个单核苷酸多态性位点(SNPs)，以此获得了毛竹基因组变异图谱，并对9个重要的性状、形态学特征、物理(密度)和机械性能相关性进行全基因组关联分析，以识别候选基因[6]。Yu X L等通过定量蛋白质组学确认了毛竹10 376个预测编码基因，蛋白质组分析还揭示了1 015个预测长非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)的蛋白质编码潜力，占注释lncRNA的51.03%。因此，基于质谱的蛋白质组学为基因注释提供了可靠的方法[7]。

除毛竹外，研究学者还对麻竹开展了研究，早在2011年Gao Z M等已经以麻竹幼叶为材料构建归一化cDNA文库，共获得9 574个高质量表达序列标签(Expressed Sequence Tags，ESTs)，其中unigenes 5 317个，contigs 1 502个，singletons 3 815个[8]。2012年Liu M Y等对麻竹进行了从头转录组测序，建立了1个完整的数据集，测序产生了15 138 726个reads，将它们组装到103 354个scaffolds后共鉴定到68 229个unigenes，这些麻竹特有的基因有助于更好地了解麻竹的基因多样性[9]。Zhao H S等则在2013年获得了麻竹的11 513 607个原始序列reads，鉴定出了81个新miRNAs，获得了162个潜在靶点，这些靶点是植物生长发育中发挥重要作用的转录因子，通过对miRNAs的鉴定为麻竹及相关物种的研究提供了理论基础[10]。Guo Z H等还构建了1种六倍体麻竹的高密度遗传连锁图谱[11]。Tu M等对麻竹愈伤组织芽器官发生的5个阶段的组织样本进行测序，获得了73 209个高质量的非冗余性转录本亚型，长度主要在1 000～3 000 bp之间。同时还预测了72 576个编码序列(CDSs)，N50值为1 176 bp，相关蛋白序列为68 269个，该数据为后续麻竹的基础研究和应用研究提供有价值的资源[12]。Zheng Y S等在2022年首次破译并组装获得染色体水平的六倍体麻竹分型基因组，大小为2 737 Mb，contig N50和scoffolds N50分别为2.57和4.5 Mb。该研究将麻竹组装成3个分型亚基因组(AABBCC)，共注释了135 231个蛋白质编码位点，发现两套分型染色体之间存在大量单核苷酸变异(SNVs)和插入缺失标记(InDels)，该结果为深入研究亚基因组的进化关系及等位基因特异性表达奠定了基础。这一高质量的六倍体基因组和全面的链特异性转录组数据集将为以麻竹为模式物种进行竹子研究奠定基础[2]。

Li W等在2021年发布了高质量的二倍体草本竹子(Raddiadistichophylla)589 Mb全基因组草图，测序共产生了253.94 Gb的短测序reads，contigs和scoffolds的N50长度分别为86.36 kb和1.81 Mb，共注释了30 763个基因，平均转录本大小为2 887 bp，该竹子基因组序列将为全球竹子物种的生物研究、种质保护等提供新的见解[13]。

基于目前数个竹种基因组数据的公布，研究学者们在此基础上不断开展对竹子基因家族鉴定和特性研究，比如细胞壁生物合成关键基因家族HCT(hydroxycinnamoyl-CoA, shikimate/quinate)和 CCR(cinnamoyl CoA reductase)[3]、萌发延迟(Delay of Germination1，DoG)家族[14]、 泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific protease，UBP)等基因家族[15]。竹子基因家族的鉴定与研究为竹子品种创新提供了候选基因和理论支撑，有利于推动竹子种质资源的发展。虽然目前有了毛竹和麻竹的基因组数据，但对庞大的竹子家族而言竹子的基因组学仍需要不断地研究和完善，随着新测序技术的不断更新，基因组学相关研究实现快速发展，以高通量测序技术为基础的各种组学研究广泛应用于竹子等植物的各个领域。测序技术的成熟加上测序成本的降低，越来越多的竹子品种的基因信息被破解。而竹子的全基因组测序工作仍需继续推进，毛竹等竹种的功能基因组学研究远不及水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)等农作物，因此建立1种包含基因组、转录组、蛋白组等相关数据的综合性数据库显得尤为重要。

1.2 竹子关键功能基因

基于毛竹和麻竹基因组数据的公布，在其各自生长发育过程中发挥重要作用的关键基因陆续被鉴定出来，以下针对已有的相关研究进行总结。

1.2.1毛竹茎竿快速生长相关基因 竹子具有生长快、产量高和材性好等诸多特性，是可快速补充的可再生资源，可作为木材的良好替代品。作为速生树种，竹子具有比普通树种高35%的吸收二氧化碳和释放氧气的能力，对环境保护至关重要，在实现碳达峰碳中和中具有至关重要的作用。为了更好地运用竹子的生长优势，该文整理和总结了近年来竹子快速生长方面的研究成果。根据前人研究可知竹子的快速生长与光合作用、油菜素甾醇(Brassinosteroids，BRs)生物合成和苯丙素生物合成有关。大多数竹种都有木质化的高大茎竿，竹子木质茎的快速生长可视为竹子的重要特性。Jin G H等在毛竹的进化过程发现竹系特有的1 622个基因，这些基因被称作“孤儿基因(特有新基因)”，“新基因”与表达分化的全基因组加倍(WGD)基因都在茎竿快速生长模块中高度表达，说明毛竹的快速生长受到这些基因的影响[16]。天门冬氨酸蛋白酶(Aspartic proteases，APs)是一类天门冬肽酶，Wang X Q等研究发现毛竹中的AP基因(PhAPs)表现出组织特异性表达模式，并可能通过整合光和赤霉素等环境信号影响毛竹快速生长，包括细胞程序性死亡、细胞分裂和伸长[17]。Huang B等发现PeLBDs基因在竹笋快速生长过程中表达，PeLBD20、PeLBD29、PeLBD46、PeLBD10、PeLBD38和PeLBD06的表达与竹笋的快速生长发育呈正相关。其中正相关性关系最显著的是PeLBD20和PeLBD38，推测它们在毛竹快速生长期起着重要的生物学作用[18]。Zhang Z J等发现PeDoG基因家族也与毛竹早期枝条的快速生长有关[14]。Huang B等发现毛竹的热休克转录因子(Heat shock transcription factor，HSF)PeHsfs在芽快速生长过程中特异表达[19]。Niu L Z等以芸香竹(Boniaamplexicaulis)作为研究对象，揭示了DNA甲基化在调节竹笋快速生长中的重要性，并表明DNA甲基化与木本竹的发育时间或年龄有关。Guo X Q等从毛竹中分离出了9个酸性转化酶(Acid invertases，INVs)，包括7个细胞壁酸性转化酶(PhCWINV1—7)和2个液泡酸性转化酶(PhVINV11、PhVINV12)。酶活性分析发现INV活性在快速生长的组织，如茎节间的延伸部位显著升高，且分别在持续表达PhCWINV1、PhCWINV4和PhCWINV7的转基因拟南芥(Arabidopsisthaliana)中其株高明显高于对照植株，说明INVs能促进植株株高的生长，因此猜测INVs在竹子的快速生长方面也发挥着一定作用[20]。同源异型盒转录因子KNOX(KNOTTED1-likehomeobox)通过调控靶基因来维持分生组织中的激素，在毛竹茎竿的快速生长中发挥着重要作用。刘青等克隆了麻竹DlKNOX基因，发现DlKNOX在节部的表达丰度最高，为日后进一步研究DlKNOX在麻竹茎竿发育中的功能奠定了基础[21]。Wei Q等通过转录组和qPCR分析发现在孝顺竹(Bambusamultiplex)中糖分可能通过抑制蔗糖非发酵-1基因(sucrose non-fermenting 1，BmSnf1)的表达来促进节间的快速生长[22]。以上研究，为后续深入探索毛竹快速生长的分子机制奠定了基础，同时为培育竹子新品种提供了候选基因。此外，单碱基甲基化分析揭示全基因组DNA甲基化的动态变化和木本竹子茎部的快速生长具有相关性[23]。

1.2.2毛竹木质化相关基因 木质素属于次生细胞壁结构的重要组成部分，羟基肉桂酰辅酶a(hydroxycinnamoyl-CoA，shikimate/quinate，HCT)和肉桂酰辅酶a还原酶(cinnamoyl CoA reductase，CCR)家族蛋白作为关键酶可以催化苯丙素途径产物转化为木质素[3]。Wang J L等认为在毛竹中，苯丙素中间体可能通过苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)或者4-香豆酸辅酶a连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase ，4CL)的催化作用转化为木质素或类黄酮。推测PAL和4CL可能在该转化过程中发挥着重要作用[24]。NAC(NAM，ATAF和CUC)转录因子已被证实在许多生物学过程中发挥重要作用，包括芽顶端分生组织的形成和维持、激素信号、细胞分裂，尤其是调控次生细胞壁(Secondary Wall，SCW)的合成[25]。Shan X M等通过对毛竹NAC家族的研究，发现了毛竹PeNAC8、PeNAC36和PeNAC73作为转录激活因子可能通过调控细胞次生壁合成参与木质化过程[25]。Que F等研究发现PeTALEs(Transcription Activator Like Effectors，TALE)在毛竹次生细胞壁的生长发育中起着重要的调控作用，该基因家族PeBLH11、PeKNOX11、PeKNOX13、PeKNOX2、PeKNOX3、PeKNOX5、PeKNOX7和PeKNOX9可能参与了快速生长阶段次生细胞壁木聚糖合成的调控[26]。Yang Y等研究发现尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(Uridine diphosphate glucose dehydrogenases，UGDHs)是毛竹细胞壁合成的关键酶，该酶的编码基因是PeUGDH4[27]。毛竹木质化的研究，为进一步探究竹子快速生长与细胞壁结构代谢过程的相关性提供参考。

1.2.3竹子花发育相关基因 竹子开花期不稳定，频率低，且大多数竹子开花后集体枯萎，这会导致竹林面积减少，竹子产量降低，造成严重的经济损失和生态环境破坏。因此，研究参与竹子开花发育的关键基因十分必要。在该文中我们对目前已有的相关研究进行总结。张颖研究发现毛竹PheDof-1(DNA binding with one finger，Dof)在花发育的早期具有很高的表达，其中PheMADS-14在毛竹花器官中表达最为明显[28]。Peng Z H等发现在开花基因网络中，开花关键基因CONSTANS和花途径整合因子(Floral Pathway Integrator，FPI)的调控序列中发现插入片段，导致其表达量降低，毛竹长时间营养繁殖导致花发育迟缓[3]。Dutta S等发现bZIP家族BtFD1参与了花和营养发育，而且对开花具有正向调控作用。BtFD1的组成型表达导致植株矮化，花梗长度和花/植株数明显减少，表明BtFD1基因的及时表达可能是其在植物中发挥程序性发育作用的关键[29]。Hou D等从绿竹(B.oldhamii)中鉴定到1个SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1 (SOC1)基因过表达抑制子BoMADS50，BoMADS50在成熟叶片和花原基形成时期高表达，BoMADS50与BoAP1蛋白在调控绿竹开花过程中具有协同作用。与此同时，还发现BoMADS50和BoMADS50-1/2/3/4可能是该竹重要的正开花调节因子[30]。Dutta S等发现毛竹中可能存在CONSTANS(CO)-FLOWERINGLOCUST(FT) CO，FT基因拷贝数的增加和表达差异的增加在光周期介导的竹子开花过程中起着重要作用[31]。Zhang Y T通过对毛竹的MADS-box基因在花器官和叶片中的表达分析发现PeMADS5作为开花激活因子，参与了毛竹的开花过程[32]。Huang B等发现PeLBD12、PeLBD44、PeLBD30和PeLBD22在毛竹圆锥花序中显著高表达，提示它们可能参与了毛竹花的发育。除此之外，还发现了在花中特异表达基因PeLBD25[18]。Huang B等基于热休克转录因子(Heat shock transcription factors，HSF)在毛竹不同组织中的表达谱，发现许多PeHsfs在穗部表现出较高的表达水平，这些PeHsfs基因可能参与了毛竹穗部发育[19]。在麻竹中，高志民等发现麻竹DlMADS18可能参与其开花时间的调控[33]。陈东亮研究发现DlAP2可能具有促进麻竹开花的功能[34]。Fan H J等则通过转录组分析发现DlFT1在麻竹中表达显著上调，而DlFT1的表达受DlCO1调控，提示麻竹中可能存在CO-FT调控模块，这些结果表明DlFT1是1个具有促花功能的候选基因[35]。Cheng Z C等人发现毛竹Phe-miR159通过调控AtMYB33表达，负向调节花药内皮层次生增厚相关基因表达，最终影响花药开裂[36]。以上研究对未来竹子花发育相关的关键功能基因挖掘提供了研究方向。

1.2.4竹子生长发育相关基因 生长调节因子(Growth-Regulated Factors，GRFs)在植物整个生长发育过程中有着重要作用。Shi Y N等从毛竹基因组中鉴定了18个GRF基因，并从中筛选出了在不同组织中表达水平较高的基因PeGRF11[37]。Guo Z H等在木本竹子中发现类SOC1基因的缺失/故障、PRR(Pseudo-Response Regulator)基因的正向选择以及GA(Gibberellin)通路关键酶编码基因的拷贝数变异共同调控了木本竹子的营养生长期[11]。在毛竹的整个生长发育过程中，细胞分裂在毛竹生长前期发挥关键作用，细胞伸长则在生长后期起着主要作用。Li L等研究发现在毛竹生长发育过程中，E2F/DP转录因子对细胞周期的表达起着调控作用，并且当毛竹受到非生物胁迫时，PheE2F/DPs的表达水平显著升高，说明毛竹可能通过转录调控响应非生物逆境[38]。泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin-Specific Proteases，USPs)是去泛素酶中最大的一类，调控植物的发育和胁迫反应。Wu R H等发现在毛竹叶片PeUBP大部分基因出现高表达，说明PeUBP可能参与了叶片的生长发育[15]。Huang B等研究发现毛竹HSF在穗和嫩枝中大都有很高的表达，说明它们可能在毛竹的生殖生长和嫩枝的快速生长中发挥着重要作用[19]。磷脂酰-乙醇胺结合蛋白(PEBP)家族对毛竹地上分枝和地下侧芽的发育均有调控作用[19]。Zhao J W等研究后发现PheTFL9、PheTFL2和PheTFL8可能通过激活休眠芽而促进毛竹生长发育[39]。

随着麻竹基因组数据的公布，调节麻竹生长发育的关键基因也有所研究。Qiao G R等通过对麻竹基因共表达网络分析，发现EXPB3和TCP可能在细胞分裂和分化中起调节作用[40]。赤霉素(Gibberellic Acid，GAs)在植物生长发育的整个过程中发挥着调控作用。目前已经从麻竹中成功分离获得GAs 信号转导途径中的关键基因DlmDELLA[41]。之后Jin K M等在麻竹基因组中鉴定到66个编码TCP转录因子的基因，并在DlTCPs的启动子区发现了与生长发育和应激反应相关的顺式作用元件，而且DlTCPs在嫩枝和叶片中表达较高。进一步研究发现DlTCP12-C是OsTB1的同源基因，是侧芽出芽的关键节点基因，对腋芽发育和侧枝生长发挥负调控作用[42]。

1.2.5其它关键功能基因 对于竹子而言，它们的生长发育受到多种因素的影响，例如温度，水分和生物胁迫等。Cheng X R等在毛竹中鉴定到35个三螺旋转录因子(Trihelix Transcription Factors，TTFs)，其中PeTT19和PeTT35在叶片中均有高表达，推测这2个基因与气孔或光合作用相关；PeTTF27表达受SA、ABA和MeJA显著诱导；部分PeTTFs在干旱和盐胁迫下表达变化明显，暗示这些基因在毛竹响应非生物胁迫反应中发挥着关键的调控作用[43]。Ma R F等发现毛竹锌指转录因子PeYABBYs含有大量的激素响应元件和应激响应元件，包括GA响应元件(GAREs)、厌氧响应元件(ARE)等，说明PeYABBYs基因可能参与植物激素的响应过程。研究发现在毛竹生长发育过程中YABBY高度富集并参与植物叶片发育[44]。Jin K M等发现所有的膨胀蛋白PeEXs都有ABA响应元件，尤其是PeEXPA1、PeEXPA20、PeEXPB5和PeEXLA4，这些基因在非生物胁迫下可能积极参与相关信号通路的调控，其中PeEXPA19与ABA响应密切相关[45]。Wang T T等发现PeGATAs与毛竹非生物胁迫有关，可能对赤霉素和脱落酸有响应，PeGATA9与竹子根茎细胞生长呈负相关，而侧芽的细胞生长则受到PeGATAs的负向调节作用[46]。Wu M等对毛竹WRKY转录因子家族成员进行了全基因组鉴定，发现PeWRKY83是通过调控胁迫诱导产生的ABA合成在耐盐性中发挥积极作用[47]。PheWRKY72-2可能通过作为气孔关闭的正向调节因子来增强植物对胁迫的耐受性[48]。在PeLBDs启动子中含有MYB结合位点，参与干旱、高盐和低温反应的诱导[18]。Zhang Z J等发现PeDoGs作为bZIP转录因子可能通过调控Polarlike1 (PL1)基因的表达在毛竹中发挥疾病应答作用[14]。Wu R H等对所有PeUBP基因的启动子进行分析，发现了许多与ABA、MeJA和SA相对应的顺式调控元件，表明PeUBPs在植物发育和胁迫响应中发挥作用[15]。拟南芥在茉莉酸(Jasmonic Acid，JA)处理下可导致在植物防御中发挥重要作用的硫代葡萄糖苷(glucosinolate)水平的升高。PeIQDs在PEG和MeJA处理下均被增加或抑制，推测毛竹IQD基因在抵御食草性昆虫和干旱胁迫方面可能具有类似的生物学功能[49]。Huang B等对PeHsf启动子顺式元件进行分析，发现毛竹HSFs的表达受植物发育过程和非生物胁迫响应相关顺式元件的调控，热响应是PeHsf蛋白的主要功能，PeHsf转录因子还参与大分子生物合成、RNA生物合成、氮化合物代谢、细胞生物合成、初级代谢以及RNA代谢过程的调控[19]。Xiang M Q等对麻竹的研究发现过表达玉米leafcolor(Lc)基因，可以获得花青素水平显著提高的麻竹转基因株系，从而提高了麻竹对低温和干旱胁迫的耐受性[50]。

2 竹子组织培养和遗传转化体系研究现状

2.1 竹子组织培养研究

竹子组培研究起步始于1968年，但研究进展相对迟缓，直到20世纪80年代国外学者才较为系统地进行了竹子组织培育研究的工作。通过组培方式进行竹子培育, 被认为是中国加快发展竹子生产的一个新途径[51]。近年来，丛生竹类竹子组织培养的研究成果约占90%，散生竹和混生竹也有不少研究报道。该综述以不同竹种为研究对象，对现有竹子组织培养的科学研究工作进行了总结，进一步革新了竹子培育技术和优化竹子培育方法, 为后续竹子再生和遗传转化体系的完善提供参考，为竹子的合理利用提供理论基础，以更好地实现竹子的生态、社会价值和效益[52]。

研究者们目前已经建立了包括以笋用为主的笋用竹[53]、常绿小乔木多花山竹子(Garciniamultiflora)[54]、混生竹类矢竹(Pseudosasajaponica)[55]；散生竹类黄甜竹(Acidosasaedulis)[56]、毛竹[57]、雷竹(Ph.violascens‘Prevernalis’)[58]、佛肚毛竹(Ph.edulisf.ventricosa)[57]；丛生竹类曙箣竹(Sasaversicolor)[59]、马来甜龙竹(D.asper)[60]、糯竹(Cephalostachyumpergracile)[61]、孝顺竹[62]、慈竹(B.emeiensis)[63]、巨龙竹(D.sinicus)[64]、版纳甜龙竹(D.hamiltonii)[65]等竹种完整的再生体系。以上研究大大推动了竹子的培育进程。

2.2 竹子组织培养影响因素

竹子再生是无性繁殖的过程[66]。该文从不同方面归纳总结了不同竹种的组织培养再生体系，包括竹子外植体的选择、培养基种类、生长调节剂与添加物和抑制褐化方式等。

(1)外植体：外植体的选择是开展竹子组织培养的第一步，已有研究表明，种子、播种苗枝条、以芽繁芽、胚培养、芽尖、根等许多组织或器官都可以作为竹子进行组织培养的外植体。不同的竹种选取的外植体种类不同，多数采用幼嫩茎段、成熟的种胚和嫩芽为再生的材料，它们具有快速长成根状茎或者迅速再生的优势。此外，有一些竹种采用其它材料作为外植体，如王曙光对巨龙竹开展研究后发现种胚和小穗茎节更合适作为外植体诱导愈伤组织[64]。乔桂荣以麻竹花药为外植体，成功诱导出了体胚并直接分化成苗[67]。以上研究表明了不同竹种组织培养选择外植体不同，合适的外植体能快速促进愈伤组织的诱导发育。

(2)培养基：植物组织培养的培养基是影响再生体系是否成功的重要因素之一。目前，大多数竹子组培的基础培养基为MS(Murashige and Skoog)培养基，也有一些竹种采用1/2 MS和3/4 MS培养。唐磊研究发现以圣音竹(Ph.edulisf.tubaeformis)当年生嫩芽为外植体时，最适合的基础培养基为3/4 MS，新萌发嫩芽则采用1/2 MS[68]，江涛研究发现毛竹幼芽在MS1培养基上扩繁和分化效果最好[69]。覃和业等对麻竹生根培养基的研究发现，1/2 MS为基础的培养基诱导的生根苗移栽成活率均在80%以上，总体上优于MS培养基[70]。

(3)生长调节剂与添加物：生长调节剂是影响植物愈伤组织生长发育的重要因素之一。通过对已发表的竹子整个组织培养过程的研究和归纳，发现IBA、2,4-D、NAA等生长素使用广泛，6-BA、KT是常用的细胞分裂素。竹子不同的组织培养时期，培养基使用的生长调节剂和添加物也不同。以黄甜竹为例，王舒对不同时期组织培养基的成分进行研究，发现添加2,4-D、6-BA、KT的培养基是最适宜的愈伤组织诱导培养基，而丛生芽诱导的培养基添加6-BA、KT、TDZ、NAA，丛生芽增殖和再生植株生根的生长调节剂也有所不同[56]。江涛研究发现毛竹在MS+3 mg·L-1NAA条件下愈伤组织生根比率最高，达到(47.71±3.98)%[69]。徐振国等为了提高麻竹的扦插生根率，在基础培养基中添加泥炭，激素选择为NAA，激素浓度处于40～80 mg·L-1时扦插苗各指标最佳；泥炭+生根粉ABT+80 mg·L-1NAA为最佳处理组合[71-72]。

(4)褐化：褐化是影响组织培养效果的重要影响因素之一，严重的褐化会导致组培材料的死亡。因此，研究学者对如何减少褐化问题开展了许多研究，发现抑制褐化可以采用抗氧化剂、改变光照和温度等方法。不同的竹种抑制褐化采取的措施不同，赵康对佛肚毛竹防褐化研究中发现接种前用100 mg·L-1的半胱氨酸浸泡种胚，在培养基中添加10 mg·L-1抗坏血酸后置于黑暗环境培养能有效地抑制褐化现象[57]。而唐磊对圣音竹的研究发现，在培养基中同时添加100 mg·L-1PVP和40 mg·L-1Vc后可以有效地抑制褐化，使褐化率降低到16%[68]。

总体来说，竹子组织培养体系已经越来越完善，但是依然存在一些难以解决的问题，如组培材料的污染是最常见的问题，在外植体初培养阶段最容易污染，造成的原因可能是材料带菌，也有可能是接种污染，因此组织培养的第一步就需要做到尽可能无菌。褐化和玻璃化也是组培过程中常见的问题，造成褐化的原因有很多，包括非酶促褐变和酶促褐变，“玻璃化”是组织培养过程中特有的1种生理失调或生理病变[52]，为了解决这类问题还需进一步改善培养基的配方。

2.3 竹子遗传转化研究

随着毛竹基因组和麻竹基因组数据的公布，与竹子重要经济性状相关的候选基因陆续被挖掘，建立完善高效的遗传转化体系对于研究竹子关键基因的生理功能显得尤为重要。随着不同竹种组织培养技术体系的不断完善，目前已经有许多研究学者发表了竹子遗传转化体系，推动竹子种质资源的创新研究。植物遗传转化最常见的技术为农杆菌介导法，例如麻竹[73]、马来甜龙竹[60]等大多数竹种已经建立农杆菌介导转化体系。诸葛菲通过农杆菌介导法成功培养了具有花青素合成相关调节基因的马来甜龙竹芽尖愈伤组织[60]。张宁采用农杆菌转化版纳甜龙竹抗性愈伤组织获得了转基因的白化苗，愈伤组织和再生苗通过检测证明GUS基因已经成功转入版纳甜龙竹[65]。张玲等利用农杆菌介导法获得表达codA基因的麻竹转基因植株，提高了麻竹的耐低温能力[73]。但是农杆菌转化受到众多因素的影响，比如菌株侵染时间、共培养时间等。为了构建更加高效稳定的竹子遗传转化体系，研究学者探索出了新的方法并通过实践得以验证。诸葛菲采用基因枪介导法将绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)导入马来甜龙竹芽尖愈伤组织中[60]。CRISPR/Cas9等第三代基因编辑技术是1种高效的基因位点特异性编辑技术，但在竹子中的应用少之又少。叶善汶完善了毛竹的瞬时转化相关体系，成功验证CRISPR/Cas9体系可以应用于毛竹原生质体[74]。之后Ye S W等对竹子原生质体中的CRISPR/Cas9系统进行了优化，利用玉米UBI作为启动子驱动Cas9表达构建了UBI-Cas9/OsU6b-sgRNA，应用于麻竹内源基因编辑。利用CRISPR/Cas9技术对六倍体麻竹进行了基因改造，在第一代转基因株系中获得了纯合子突变，得到一株株高改变的竹子突变体。2022年Huang B Y等首次建立了毛竹的遗传转化体系，以毛竹未成熟胚为外植体诱导不定芽和愈伤组织分化，在此基础上，利用PeU3.1 snRNA启动子驱动sgRNA表达，在毛竹中实现了基于CRISPR/Cas9的基因组编辑，这些技术体系将有利于毛竹重要基因的生理功能验证[75]。以上这些证明CRISPR/Cas9在竹子中的适用性，一定程度上促进了未来竹子功能基因的研究和育种[76]。随着生物技术的发展，竹子转基因体系也不断更新和进步，但不同竹种遗传转化体系的建立仍存在许多难题。目前最新获得的毛竹遗传转化体系以胚作为外植体材料，存在如果胚龄过小，几乎透明，没有明显的芽点，而高成熟度胚难以从硬胚乳和种皮中分离出来等问题[75]。虽然麻竹、毛竹等竹种的遗传转化体系已经建立，但仍有大部分竹种的遗传转化体系还在探索中，研究学者也在寻找除了传统的遗传转化方式之外的新方法。对于难以再生的竹种，可根据竹子体细胞胚诱导率高低的类型构建再生植株；也可以通过优化转基因技术以及人工培养条件采用基因编辑技术等构建竹子的遗传转化体系，竹子原生质体—原生质体融合—原生质体复壁成细胞团—植株再生的实验路线，也是有效改进竹子遗传育种技术的手段[66]。综上所述，竹子组织离体培养再生的过程既受到外部环境的影响，又受到竹子自身条件的制约。如何不断完善竹子遗传转化体系，为竹子种质资源的创新提供更多高效途径是未来研究的重点。

3 应用与展望

如今，竹子的基因组和关键功能基因的挖掘越来越多，但仍存在欠缺，包括至今只有毛竹、麻竹有发布相关基因组，其余很大一部分竹种还在探索中，未来需要不断完善已公布的竹种基因组和研究发现新的竹种基因组，这将会是一项巨大的工程。其次，对竹子关键基因的挖掘还需进一步拓展，某些关键功能基因还未被发现和验证，而竹子功能基因的验证需要运用遗传转化体系，目前已经有许多研究学者开展了新的植物转基因技术研究，包括采用竹子花叶病毒、纳米材料和花粉等遗传转化的方法。关于纳米材料和花粉以及花叶病毒的应用已经有研究学者在其它物种中开展研究，且已发表了系统的文章和方法。Kwak S Y等在拟南芥中实现了用纳米颗粒介导的叶绿体转基因的方式，叶绿体转化不存在外源基因向杂草亲属扩散的问题，可以作为成熟植物的一种转化方式[77]。Li S J等发表了1种运用纳米孔的方法来确定大豆基因中插入玉米Ds转座子，这种方法同样适用于其它生物体，该方法还可以用靶向单个转基因的探针定位植物体内插入的转基因，是一种有效的转基因方式[78]。Lv Z Y等报道了1种新的转基因方式，通过花粉转染，将外源基因成功地转入了玉米自交系，并成功表达，其后代同时还具有高度的遗传稳定性，为以胚芽进行基因编辑育种材料的遗传转化提供了借鉴[79]。Zhao X等利用磁场转染花粉，将外源DNA附在具有磁性的纳米颗粒上，通过磁场传递到花粉中进行授粉，获得转基因植株使得后代带有目标基因，该方法对新品种的育种有很大的参考意义[80]。Bouton C等研究出利用狐尾花叶病毒(Potexvirus)作为载体，在插入目标基因后GFP可以在小麦和玉米中瞬时表达[81]。随着转基因技术的发展和进步，未来有望将这些新技术应用到竹子遗传转化中。

因此，在前人研究的基础上，我们可以通过借鉴和参考，推动为竹子种质创新研究的新发展。提高测序技术和分子生物学技术、建立系统完善的组织培养体系、创新转基因技术以及探索现代竹子应用新方向是今后的研究重点。竹子是目前研究的热门植物，未来对于竹子种质创新的研究将会越来越进步和完善。