神经丝轻链蛋白在多发性硬化中的研究进展

王佳琪 侯苗苗 刘晓蕾 李新毅

1）山西医科大学第三医院（山西白求恩医院 山西医学科学院 同济山西医院），山西 太原030032 2）山西医科大学第三临床医学院，山西 太原 030000

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种由免疫介导的累及中枢神经系统的炎症性神经退行性疾病，患病率逐年增加，与2013年相比，2020年患病人数增加了30%［1］。MS 主要以进行性神经元轴索损伤、脱髓鞘改变、临床表现多样性以及病灶的时间空间多发性为典型特征，其确切病因尚未明确，遗传、其他自身免疫性疾病（1型糖尿病、甲状腺疾病、肠道炎症等）、传染病（爱泼斯坦-巴尔病毒）、维生素D缺乏、肥胖等均有可能导致该病［2］。大多数风险等位基因与免疫途径基因相关，为免疫系统对MS的发展至关重要的假设提供了支持［3］。MS免疫病理的最终环节为促炎免疫细胞和缺陷的调节免疫细胞之间的不平衡，最终破坏血-脑屏障，造成不可逆的髓鞘细胞和少突胶质细胞的原位损伤［3］。临床病程以复发缓解 型 MS（relapsing remitting multiple sclerosis，RRMS）最为常见，绝大多数最终会进展为继发进展型 MS（secondary progressive multiple sclerosis，SPMS），这种反复的不可逆的脑组织损伤造成的进行性残疾累积给患者及家庭带来极大的身心负担。然而，目前针对该病的诊断、分型以及疗效监测主要依据临床参数及放射学参数，仍缺乏常规诊断、疾病监测和预后随访的指标。神经丝轻链蛋白（neurofil⁃ament light chain protein，NFL）是神经丝蛋白家族中可溶性最高和最丰富的亚基，是神经元结构蛋白中最重要的组成成分，由于其对轴突损伤的敏感性和在脑脊液和血液中测量的可靠性，在MS的研究中受到广泛关注。

1 神经丝轻链蛋白

1.1 概述神经丝是中枢和周围神经系统中神经元和轴突细胞骨架的关键组成部分，根据神经元类型和发育阶段，由5种亚基以不同的组合和浓度共同组装成神经丝异质聚合物［6］，可分为神经丝轻链、中链和重链［轻链（NFL，61.5 kDa，543 个氨基酸）、中链（NFM，102.5 kDa，916 个氨基酸）和重链（NFH，111.9 kDa、1 020个氨基酸）］神经丝以及中枢神经系统中的α-内联素和周围神经系统中的外周蛋白［5］。所有亚基包括1个N末端头部结构域、1个高度保守的中央杆结构域和1 个长度可变的尾部结构域。除此分子结构外，它们还经历翻译后修饰，包括磷酸化、O-连接糖基化、硝化和泛素化［7］。其在大口径的有髓轴突中高度表达，负责神经元结构稳定性，具有较高的传导速度，并且促进轴突径向生长［4］。与细胞骨架蛋白（如肌动蛋白）相比，神经丝在神经-轴突隔室中具有特异性和丰富性［8］。其中NFL是神经元和轴突中最丰富的中间丝，在轴突细胞骨架的组装和维持中起着重要作用［5］。最新的一项对死亡供者的中枢神经系统17 个解剖区域的神经胶质蛋白的浓度研究测定发现，颞叶和枕叶脑白质中的NFL浓度［27（15～50）至30（17～54）μg/kg］高于大脑皮质［12（8.6～17）至14（10～18）μg/kg］或额叶和顶叶脑白物质［10（5.4～19）和17（9.9～30）μg/kg］，表明大脑白质中存在前后梯度，浓度增加的幅度更大，在海马、内囊、丘脑、中脑、脑桥、颈脊髓等部位也可见高浓度的NFL［9］。神经丝的生理降解被认为是泛素介导的蛋白酶体和凋亡通路的结合［10］。在正常机体的脑脊液和血清中也可发现低水平NFL，以年龄依赖的方式从轴突中持续缓慢释放，其可能与衰老相关［12］。当神经细胞或其轴突膜受损时，NFL 被释放到间质液（interstitial fluid，IF）、脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）和血液中［11］，细胞外检测NFL可用于监测疾病进展、治疗反应或药物毒性。一旦进入外周血，这些高度免疫原性蛋白就会诱导特异性体液反应产生抗神经丝抗体，其水平随神经疾病进展而变化，目前其致病性和监测疾病进展的潜在价值均不清楚，本文不过多赘述。

1.2 定量分析在神经系统疾病的管理中，轴突损伤的识别和量化一定程度上可以提高诊断的准确性和预后评估。随着各种免疫分析技术的更新迭代，NFL定量分析技术的灵敏度也显著提高。截止目前共开发出4 种方法，第一代免疫印迹法，第二代酶联免疫吸附法［14］，第三代电化学发光法（ECL）［15］，第四代单分子阵列法Simoa（single-molecule array）基于珠粒技术，比ECL 敏感25 倍，比ELISA 方法敏感126倍［14］，尤其适用于外周超敏蛋白的检测，可以检测到正常老化期间或轻度损伤后NFL 浓度的微小变化［16-17］。Simoa 测量的脑脊液和外周血NFL 水平与临床和影像学结果有良好的相关性［18］，进一步支持NFL 作为MS 生物标志物的可靠性。其他几种检测平台现在也显示出接近等效的动态范围和可检测水平。西门子正在开发一种使用Quanterix NFL抗体的bNFL免疫分析方法，旨在获得与Simoa bNFL水平的良好相关性，以提供一个常规NFL 测试平台，加快NFL 测试的全球可用性［19］。LEE 等［20］通过研究验证ADVIA 34 Centaur®XP 免疫分析系统上新型血清神经丝光（sNFL）分析的性能。这些检测方法及平台技术的差异凸显了检测方法标准化的必要性，以及多位点验证在重复性和创建标准化方案方面的作用。

2 NFL与MS诊断

由于临床症状的短暂性和多样性、个体间病程的变异性以及与个体变异相关的主观性，使MS的诊断面临极大挑战。MS 的传统诊断和进展标准主要基于临床表现与磁共振图像（MRI）、脑脊液分析和视觉诱发电位，一定程度上增加了误诊风险。研究发现新兴的MS诊断生物标志物，包括近期出现的各种中央静脉标志物、顺磁边缘损伤和流体生物标志物，尽管神经影像在MS识别中有独特的成像结果，但在疾病早期阶段难以量化，流体生物标志物的发现和验证更有可能显著提高诊断的可靠性。BJORNEVIK等［21］通过嵌套病例对照研究，评估血清NFL 水平与MS发病之间的相关性，结果表明在临床症状发生前个体中血清NFL 水平的增加与未来发展MS 的风险增加有关，MS 可能存在前驱期，逐渐发生轴突损伤。临床发病时间也与sNFL水平相关，最早可追溯到在临床MS 开始6 a 前［21］，因此早发现可以早期开展治疗避免加重残疾。一项荟萃分析比较MS 患者和对照组脑脊液NFL 的研究［22］发现MS 人群中NFL浓度与对照组相比存在统计学差异。然而，在另外研究中MS 患者的NFL 水平有很大差异［23］。这些差异可能与测量方法及人群基线信息差异相关。由于NFL可以在各种生理和病理条件下释放，在MS相关组织损伤中并不是特异性的，使其在诊断与鉴别诊断方面特异性不高。大量纵向研究表明，在MS、创伤性脑损伤、脑卒中以及神经退行性慢性疾病，如肌萎缩侧索硬化症（amyotropyic lateral sclerosis，ALS）、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病等患者也存在高NFL 水平［24-25］。最佳临界值对于将NFL 用作替代生物标志物并允许及时医疗干预至关重要，但目前尚未建立标准化临界值和最佳采样频率［26］，另外年龄、性别、体重指数、共病和样本量等混杂因素需要额外研究，以避免误导NFL 数据［27-28］。因此，独立的脑脊液NFL和血清NFL似乎都不适用于MS的诊断，仍需要进一步探索。

3 NFL在MS进展恶化与复发中的作用

视神经炎（optic neuritis，ON）、临床孤立综合征（clinically isolated syndromes，CIS）或放射孤立综合征（clinically isolated syndrome，CIS）患者均有发生MS的风险，早期预测这些疾病恶化形成MS以及MS恶化发展为RRMA、SPMS，早期积极展开防控十分必要。研究发现NFL 水平在预测上述疾病转化为MS中具有明显相关性［29-33］。一项研究回顾性分析MS患者诊断时脑脊液中NFL 浓度以及5 a 和14 a 的疾病严重程度，根据双变量和多变量逻辑回归分析估计，高水平的NFL与MS 严重性风险增加3 倍相关，尤其是在最近复发的RRMS 患者中。此外，在14 a 的随访中，约60%的脑脊液NFL 水平高（>386 μg/L）的患者从RRMS 发展为SPMS，而30%的患者为中等或低水平（<386 μg/L）［33］，表明在疾病早期脑脊液NFL水平可能预测疾病进展，可能提示转化为进展性疾病。研究发现临床复发或有放射活动的MS 患者血清NFL水平高于缓解期或无新MRI病变的患者［34］。尽管NFL 水平似乎是未来疾病活动的良好预测指标，但其单独测量疾病活动和评估预后的能力仍需进一步明确。

4 NFL与影像学在MS应用中的相关性

2019 年国际进行性多发性硬化症联盟（Interna⁃tional Progressive Multiple Sclerosis Alliance）专家组通过对复发性和进行性MS 的数据分析，认为血清NFL 浓度与影像学和失能测量相关，可以预测疾病的未来病程，并可以预测治疗的反应［35］。铁缘/顺磁损伤（iron rim/paramagnetic lesions，IRPL）研究提出白质损伤周围的环形顺磁铁边界是有前景的高度特异性MS 影像生物标志物，反映了MS 患者急性进展期和慢性期以及复发和进展性疾病患者的慢性炎症脱髓鞘［36-37］，并可能与无急性炎症临床或影像学征象患者的神经轴索损伤和残疾有关。研究表明大多数IRPL 患者（72%）的血清NFL 水平高于第80 百分位（病理阈值），提示与血清NFL 相关［45］。血清NFL 的增加表明，即使是在慢性活动性/潜伏性病变边缘，也可以在血清中检测到少量的持续轴突损伤，其程度远小于活动性病变。影像学研究显示了与NFL水平更一致的相关性，一些研究报告了患病后和患病前NFL 的预测值［34，41］。因此，NFL 和MRI 指数联合在MS中有巨大的前景。

5 NFL与MS的预后

轴突退变在疾病过程中积累，是MS 患者持续神经功能障碍的主要原因。轴突退变的评估主要基于MRI 发现，特别是脑容量测量，缺乏可重复性［38-39］。测量神经细胞骨架蛋白（如NFL）似乎是评估中枢神经系统轴突损伤程度的一种综合方法。MANOUCHEHRINIA 等［40］评估血浆NFL 水平与MS疾病进展之间的相关性，发现年龄分层的血浆NFL水平高于第99、95 和80 百分位，与扩展残疾状态量表（expanded disability status scale，EDSS）的严重程度相关，认为高血浆NFL 可作为临床预后生物标志物，预测MS早期发生永久残疾的风险。同时有研究认为sNFL水平的降低与12和24个月后EDSS评分、神经心理结局和脑容量变化的改善相关［34］。短期内NFL水平预测未来复发、新的T2或钆增强病变、最终脑和脊髓萎缩的风险，以及其对短期EDSS评分恶化的预测价值被接受。但NFL相对MRI来说是否是一个更好预测神经退行性变的指标尚不能确定，因目前没有研究将NFL的性能与临床和MRI参数进行比较。

6 NFL与MS疗效监测

由于MS会导致严重的神经功能障碍，大多数患者需要疾病修饰治疗（disease-modifying therapy，DMT）。制定最佳治疗方案需要在对治疗效果和风险进行平衡，这种平衡可能随着疾病活动、治疗作用、风险环境（包括COVID）以及生命的不同阶段而改变。MRI 是唯一公认亚临床疾病活动的主要指标，但对患者短时间内的变化不敏感。有研究回顾常规和新兴MRI以及实验室测量监测DMT的疗效和风险发现，与临床测量相比，MRI和血清NFL水平与那他珠单抗治疗（与安慰剂相比）密切相关［44］。临床试验和人群队列显示有效的MS 治疗后NFL 水平降低。一项来自瑞典MS 队列的研究发现治疗前和治疗时样本之间的血浆NFL 水平有显著降低，同时发现不同药物在DMT 中血浆NFL 浓度的降低不同，阿仑珠单抗（ALM）的降低最大，特立氟米特（TFL）的降低最小［42］。一项针对CIS/RRMS 的德国队列研究表明，接受更高疗效DMT 治疗的患者更有可能具有更高的基线sNFL 和更大的sNFL 降低，在那些需要升级策略的患者中，sNFL水平下降到sNFL上升水平以下［43-46］。这些证据表明NFL 是MS 疗效具有潜在的监测价值，特别是对于高效药物，可能由于这些药物更好地预防了脑损伤，强调NFL 作为神经元和轴突损伤标志物的作用。就证据而言，追踪NFL 水平对DMT的响应具有潜在的监测价值。

7 展望

迄今为止，关于MS的液相生物学标志物研究越来越多，NFL 作为中枢神经系统（central nervous system，CNS）轴突损伤的生物对应物，研究显示出其对疾病活动和短期损伤负荷的临床和亚临床变化的敏感性，表明NFL 水平在MS 中的潜在适用性，因此NFL 是否可以作为一项MS 的常规检查进入临床诊疗，仍需要在未来不同人群的大规模纵向队列研究来明确，以及更加标准化的检测方式及检测时间点和临界值，为MS的临床定制化医疗实践提供帮助。