自然杀伤细胞在中枢神经系统疾病中的研究进展

李治国 任洪磊 周 旭 李敏淑

1）天津医科大学总医院 天津市神经免疫研究所，天津 300052 2）天津医科大学总医院，天津 300052

NK（natural killer cell, NK）细胞是一类具有独特免疫功能的天然淋巴细胞。不同于其他淋巴细胞如T 淋巴细胞和B 淋巴细胞，NK 细胞的活化不需要特定抗原的刺激，因此NK 细胞具有和其他天然免疫细胞如中性粒细胞、单核细胞等类似的快速免疫应答效应。在急性感染或组织损伤等病理条件下，NK 细胞是最早被动员的免疫细胞之一，是介导疾病早期组织炎症和免疫反应的核心免疫细胞［1］。NK 细胞可以通过产生大量的细胞因子和趋化因子促进免疫反应，也可直接发挥杀伤作用清除受损体细胞或肿瘤细胞等。NK 细胞具有的多样化免疫功能可能与其异质性表型相关。在小鼠中，NK 细胞的发育经历了从低表达CD11b 到高表达CD11b，并通过表达不同水平的CD27 进一步差异分化。发育早期的未成熟的CD11blowCD27+NK 细胞亚群主要在骨髓和淋巴结中存在，该类群细胞具有高增殖性。而CD11bhighCD27+和CD11bhighCD27-表型的NK 细胞具有较低的增殖能力，主要存在于外周血和脾脏［2］。人NK 细胞亚群的划分主要基于CD16 和CD56 分子的表达水平。成熟的NK 细胞亚群拥有CD56dimCD16+表型，具有高杀伤活性、低细胞增殖率且主要存在于外周循环血中［3］。而相对未成熟的NK 细胞亚群表型为CD56brightCD16-/dim，具有分泌大量细胞因子能力、高增殖性并主要存在于外周淋巴器官中［4］。

NK 细胞表型重塑和功能发挥受其所在特定微环境的调控并具有器官特异性。如归巢到肝脏、胰腺、子宫、黏膜组织、关节和脑等器官中的NK 细胞具有相对器官差异性的表型和功能［5］。在中枢神经系统中，NK 细胞与神经细胞、胶质细胞等存在广泛的细胞间互作，如神经元分泌的神经递质乙酰胆碱可以通过作用于NK 细胞表面的乙酰胆碱受体调控NK 细胞功能［6］，相应的NK 细胞能够通过杀伤胶质细胞或分泌IFN-γ影响脑内固有细胞的存活或发挥生物学功能［7］。

NK 细胞参与多种CNS 疾病的病理演变。早期研究主要聚焦NK 细胞在脑部肿瘤和神经感染类疾病中的作用［8-11］。近年来，NK 细胞在经典的神经免疫性疾病（多发性硬化）、脑血管病（脑缺血和脑出血）、神经退行性病变及正常脑衰老中的独特作用和机制也逐渐被认识。本文将对NK 细胞在CNS 疾病中的研究进展进行回顾和总结，并对NK 细胞在CNS疾病中的研究和应用方向进行展望。

1 NK细胞功能与中枢神经系统器官特异性

1.1 NK细胞表型和功能自然杀伤细胞（natural killer cell, NK）是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞，属于天然免疫细胞。在免疫系统中，NK细胞是最早动员到达靶器官启动炎症的免疫细胞之一［12-14］。NK 细胞具有表型和功能不同的细胞亚群，且具有物种差异性。人NK 细胞基于CD56 和CD16 表达水平，主要划分为CD56dimCD16+和CD56brightCD16-/dim两个亚群。生理状态下，外周血内循环的NK 细胞主要是CD56lowCD16+，可以通过NK 细胞表达的活化或抑制性受体与靶细胞相关配体分子进行配对识别，能够分泌穿孔素等对靶细胞进行杀伤和产生少量细胞因子［15-16］。而CD56highCD16-NK 细胞主要存在于外周淋巴器官中，通过分泌促炎因子IFN-γ、TNF和GM-CSF 等调节机体免疫应答，仅在长期激活后才能获得杀伤毒性。研究表明NK 细胞功能具有重塑性，如研究显示CD56highCD16-NK 细胞能够分化成CD56lowCD16+NK细胞［17-19］。

NK 细胞的表型具有物种差异性。小鼠的NK细胞和人NK 细胞具有很多相似特征，但是小鼠NK细胞表面缺乏CD56 等表面分子标记物，不适合用人NK 细胞的表型分子进行鉴定或亚群分类。小鼠NK 细胞可以基于CD11b、CD27、CD127 和B220 的表达划分为不同的细胞类群［20-22］。小鼠CD11bhiCD27+和CD11bhighCD27-NK 细胞亚群具有不同的激活性受体和抑制性受体以及趋化因子表达，CD11bhighCD27+NK 细胞则具有高水平的细胞因子产生和细胞杀伤毒性。此外，B220+CD11c+NK细胞在二级淋巴组织中富集，与其他小鼠NK 细胞相比，其能够产生较高水平的IFN-γ。NKp46（也被称为NCR1）被认为是人和小鼠共用的分子标志物，近年来报道提示天然固有淋巴细胞亚群（ILCs）也表达NKp46［23］。因此，对NK 细胞进行亚群分析时需要谨慎考虑特异性分子标志物的选择。

NK 细胞的活化受多种因素的调节。目前认为NK 细胞可以通过3 条途径被激活：（1）通过与IgG抗体的Fc片段结合被激活；（2）由于感染、肿瘤或应激条件下，靶细胞上与NK 激活性或抑制性受体结合的配体表达改变，从而打破了NK 细胞的耐受平衡，激活NK 细胞；（3）炎症环境刺激如大量IL-12 和IFNs的存在［24-25］。

2 中枢神经系统内NK细胞的表型和功能重塑

2.1 NK 细胞的表型和功能重塑受多种因子的调控 越来越多的证据表明器官特异性因子和细胞间相互作用，在不同器官微环境或疾病的不同阶段都影响着NK 细胞功能发挥。骨髓来源的NK 前体细胞成熟后获得相应的效应功能、趋化因子受体和黏附分子表达，并从骨髓通过血液迁移到脾脏、肝脏、肺和其他器官。NK细胞通过表达多种细胞因子受体如CCR2，CCR5, CXC-chemokine receptor 3（CXCR3）和CX 3 C-chemokine receptor 1（CX3CR1），响应多种趋化因子，从而归巢到特定炎症部位［26］。器官内特有的趋化因子在NK 细胞迁移到该器官的过程中发挥作用。如疾病状态下中枢神经系统神经元过量分泌的CX 3 C-chemokine ligand 1（CX3CL1，也被称为fractalkine），是CX3CR1 NK 细胞向脑内炎症部位趋化的关键细胞因子［27-28］，提示组织特异性因子对NK细胞归巢和功能发挥具有重要调控作用。

CNS 内特有细胞与NK 细胞间相互作用会影响归巢脑内的NK 细胞功能。中枢神经系统具有独特的抗原呈递细胞（APC，如星形胶质细胞和小胶质细胞）和抗原（神经抗原）。归巢到炎性CNS 部位的NK 细胞将接触大量CNS 特定的细胞成分，包括星形胶质细胞，小胶质细胞和神经元，这些细胞通过直接接触或分泌大量的可溶因子包括抑制性（如TGF-β、IL-10 和乙酰胆碱）或激活性分子（如ATP、UTP、谷氨酸盐、前列腺素E2、过氧化氢、nitric oxide、IL-1β、IL-6、TNF、EGF、IL-3、IL-12 和M-CSF）影响NK 细胞功能［29-31］。因此，在CNS 炎性状态下，NK 细胞接受到多种组织特异性细胞或分子信号的刺激包括可溶性分子信号，与靶细胞物理接触、抑制性和活化性信号的平衡失调等共同影响NK 细胞功能状态。

3 NK细胞与神经系统疾病

3.1 NK 细胞与多发性硬化（multiple sclerosis，MS）MS 是一种免疫介导的慢性中枢神经系统脱髓鞘疾病，并伴有继发性轴索损伤。常累及青壮年，临床表现为进展性运动功能障碍和认知下降，病理表现为广泛的免疫细胞浸润和脱髓鞘。

临床和临床前数据提示NK 细胞参与了MS 疾病病理进展。在MS 疾病的发病阶段，NK 细胞功能活性降低，而在疾病缓解期NK 细胞功能恢复［32］。MS 复发常与NK 细胞功能缺失相关，因此NK 细胞可能调控MS 的自身免疫反应及参与神经损伤修复。通过IFN-β或达利珠单抗治疗可以降低MS 的疾病复发，并伴随调节性CD56 bright NK 细胞数量增加［33-34］。此外，临床研究提示妊娠期外周血中调节性NK细胞数量增加，并伴随MS疾病活跃降低［35］。这些研究提示NK 细胞在MS 疾病中具有潜在保护作用。而在实验性自身反应性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）小鼠中的研究中，NK 细胞与MS 疾病进展和治疗反应性的作用尚存在争议。通过注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗原诱导的EAE 模型中，部分研究显示NK 细胞加重EAE 疾病进展［36］，而也有研究支持删除NK 细胞加重神经疾病损伤［37］。在CX3CR1 缺失的小鼠中NK细胞归巢到脑部受到抑制，造成EAE 诱导后形成更严重的病灶。通过抗体中和NK 细胞抑制性受体NKG2A及其配体Qa1, 能够促进NK细胞对T细胞和小胶质细胞的杀伤，从而缓解CNS炎症［37］。进一步通过IL-2/IL-2R抗体复合物扩增NK细胞可以抑制髓鞘活化的Th17细胞反应，阻滞MS进展［38］。在EAE 修复期，SVZ 区域内神经干细胞通过产生IL-15 维持NK细胞存活，并促进其增殖活化，但由于NSC 表面NK抑制性配体QA1 表达降低，致使NK 细胞对其进行杀伤，抑制神经修复［39］。值得注意的是，与靶向外周NK 细胞相比，靶向中枢NK 细胞有利于临床预后。目前大部分的研究都是聚焦于总的NK 细胞，不同NK 细胞亚群在MS 疾病进展的不同阶段所起的作用，仍是一个值得探索的问题。

3.2 NK细胞与脑卒中脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，分别由血管堵塞或破裂引发的脑内神经组织损伤。越来越多的数据显示，炎症与免疫反应参与脑缺血或脑出血的继发性脑损伤，干预神经炎症有助于改善神经功能缺损［40-43］。NK 细胞是先天免疫系统中的关键成员，可以在免疫应答的最初阶段快速活化，其在急性脑血管疾病中的作用逐步被揭示。

3.3 NK细胞与脑缺血缺血性脑卒中后脑内炎症伴随脑损伤病理演变的整个进程。在脑卒中发作后数分钟至数小时，缺血神经元的神经细胞死亡和损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）的释放触发了神经炎症，其特征包括：脑内胶质细胞的活化，外周免疫细胞的浸润以及细胞毒性因子、活性氧、基质金属蛋白酶、TNF-α和其他脑内细胞毒素的释放等［44-45］。这些免疫反应释放到细胞间的因子打破了正常的脑内微环境、损坏细胞外基质和血管内皮细胞间的紧密连接，造成细胞毒性作用、血脑屏障渗漏和缺血病灶内细胞的死亡。临床前及脑卒中免疫干预的临床概念性研究证实通过S1P 受体调节剂干预外周淋巴免疫细胞向脑内迁移，可以显著减轻缺血性脑卒中后的脑内炎症，缺血病灶并改善临床预后［46-47］，提示通过抑制脑内炎症发生是减轻缺血性脑损伤的一个途径。

NK 细胞是先天免疫系统的一个关键成员，可以在CNS 免疫应答的最初阶段快速活化。脑卒中后缺血神经元分泌的fractalkine 可以趋化NK 细胞到达脑内缺血区，卒中后回归至CNS 的NK 细胞对缺血神经元自身免疫耐受打破，通过直接杀伤或释放IFN-γ 和perforin 杀伤神经元，从而直接影响脑卒中病程进展［48］。进一步研究发现，脑内NK 细胞的活性受脑内特定细胞的调控在脑卒中之后。星形胶质细胞通过上调白介素15（interleukin-15，IL-15）激活以NK 细胞为代表的免疫细胞，细胞因子IL-15 作为星形胶质细胞和淋巴细胞之间联系的桥梁，介导了细胞免疫，扩大了局部炎症，并最终加重脑损伤，继而影响脑内的免疫炎症反应和脑卒中的预后［49］。研究结果提示，脑缺血后侵入到脑内的NK细胞具有加重缺血后脑损伤的作用。

外周免疫抑制和感染是导致脑卒中患者死亡的主要并发症之一。脑卒中引发的系统免疫功能受抑增加了脑卒中患者的感染概率。研究发现在脑缺血再灌注后不同时间，外周和脑内的NK 细胞呈现显著的免疫表型、转录组、抑制或活化功能变化，这些动态变化在卒中患者的脾脏和血液循环中均存在。儿茶酚和下丘脑-肾上腺轴激活导致外周脾脏萎缩及通过调控NK 细胞内SOCS3 表达降低NK细胞数量和功能。而在CNS，胆碱能神经支配通过调控RUX3 表达抑制NK 细胞功能。通过药物或基因敲除可以逆转NK 细胞免疫抑制，减轻卒中后感染［50］。研究提示，NK 细胞通过参与脑内和外周的免疫应答，可以影响脑缺血的神经损伤以及感染并发症的进展。

3.4 NK 细胞与脑出血（intracerebral hemorrhage,ICH）和脑缺血类似，脑出血也会引起急性的脑卒中损伤并伴随脑内炎症反应和外周免疫细胞的脑内浸润［40-41,51］。研究证明，早期抑制外周免疫细胞浸润能减轻出血后脑损伤［43,52-53］。

对脑出血患者发病早期4.5～6 h 和9～12 h 时间段的脑血肿周围组织进行免疫细胞浸润谱原位追踪，发现早期浸润脑内的免疫细胞以NK 细胞、中性粒细胞和巨噬细胞为主。其中脑血肿周围脑组织的淋巴细胞以NK 细胞数量最多，T 细胞和B 细胞较少。因此，自然杀伤细胞是脑出血早期被动员到损伤脑组织内主要的淋巴细胞，并参与非特异性的天然免疫应答。单细胞测序分析发现与外周血NK 细胞相比，浸润脑内的NK细胞颗粒酶杀伤活性（Gzmk和Ly49c等）、细胞因子（CXCL2、CXCL3、TNF和IL-1β）和细胞增殖（Coro1b、Dgat1 和Ndrg1）等基因表达显著增强，提示脑内NK 细胞增强了免疫活性。进一步对脑出血小鼠进行NK 细胞删除（抗NK1.1 单克隆抗体），发现缺乏NK 细胞后小鼠损伤脑组织内的血管内皮细胞凋亡减少。通过对脑内血管内皮细胞的表型分析发现其MHC Ⅰ类分子H2-Kb（NK 细胞抑制性受体Ly49C 的配体）表达量显著下调，而RAE1 和MULT-1（NK 细胞活化性受体的配体）表达量显著上调，进一步体外实验证实这种变化受脑出血独特成分红细胞裂解物和凝血酶的诱导产生。血管内皮细胞MHC Ⅰ类分子的变化导致脑内浸润的NK 细胞的识别和杀伤，从而加重脑血管渗漏。脑内NK 细胞通过分泌CXCL2 增加中性粒细胞向脑内浸润，促进脑内炎症的扩大。

与缺血性脑卒中类似，脑出血后患者发生感染风险增加，研究显示感染的患者外周会出现包括NK 在内的淋巴细胞缺失，并伴有不良预后。脑出血动物模型数据显示，脑出血后通过肾上腺素和HPA 轴神经支配调控脾脏萎缩及NK 等淋巴细胞功能缺失，可能是造成感染的重要因素。

4 NK细胞与神经退行性疾病和脑衰老

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）和帕金森疾病（Parkinson’s disease，PD）是常见的神经退行性疾病，分别伴随海马或黑质部位的神经细胞丢失。研究提示AD 和PD 病理可能与系统免疫功能异常相关。研究提示AD 患者的NK 细胞高表达神经递质血清素5-HT2C 受体，该受体可调控NK 细胞NKCA 的表达。PD 患者NK 细胞的抑制性受体NKG2A 表达增加，而活化性的后提NKG2D 未见有明显改变。与健康对照相比，体外利用IL-2、IFN-α或IFN-β能够增加PD 患者来源的NK 细胞中NKCA表达，且NKCA 的表达与PD 疾病严重程度呈正相关。此外，PD 患者外周血来源的NK 细胞能够自发分泌更多的IFN-β和TNF-α。这些研究提示NK细胞表型改变可能在PD 病理发生中发挥作用。但需要进一步的机制研究。

个体的神经发生会随年龄增长而减弱，但具体的机制以及免疫成分是否参与并不十分清楚。目前研究提示衰老伴随着机体系统性炎症的增加［60］。研究者观察到CD8+T细胞在老年人脑内神经发生区域的聚集和具有免疫活性，并证实CD8+杀伤毒性T产生的IFN-γ可能在抑制神经发生中发挥重要作用。不同于CD8+杀伤毒性T 细胞，另一研究发现人类衰老脑内NK 细胞的聚集主要位于脑内齿状回区域，NK 细胞多于该区域的神经前体细胞毗邻，且数量上显著多于其他免疫细胞如中性粒细胞、T 细胞和B 细胞等。进一步在小鼠模型中利用单细胞测序及谱系示踪方法发现，神经前体细胞通过产生的特异的免疫分子IL-27，激活并扩增脑部聚集在齿状回的NK细胞。此外，RNA 测序和免疫筛选等证据表明，衰老导致神经前体细胞表面的主要组织相容性复合体Ⅰ类分子（MHC-Ⅰ）Qa1 表达下调，造成免疫耐受缺失，从而在正常脑衰老过程中激活NK 细胞免疫监视，对神经前体细胞产生损伤。最后，通过注射NK1.1 单抗靶向清除衰老大脑内的免疫细胞，能够促进神经前体细胞的存活并改善认知功能。这些研究对深入理解炎性衰老的细胞和分子机制，以及探索建立衰老脑组织内神经元前体细胞的免疫耐受和改善衰老认知提供了新的预防和干预策略。

5 总结与展望

本综述总结了近年来NK 细胞在神经系统疾病中的基础研究中取得的众多进展。研究提示NK 细胞在神经免疫病、脑血管病、神经退行性病变以及正常脑衰老中均具有差异性的生物学功能或分子机制，为理解这些疾病新的致病机制和寻找新的预防或干预策略提供了新的证据，也丰富发展了NK细胞器官特异性学说。同时，靶向NK 细胞治疗CNS 疾病还处于基础研究阶段，一些关键科学问题有待未来的研究进一步阐述，包括：（1）如何在CNS疾病临床前和临床研究中，更好地验证人和动物NK 细胞表型和功能的物种差异性，加速靶向NK 细胞的药物研究和转化。（2）NK 细胞的异质性及亚群在不同CNS 疾病中的具体的作用和机制有待进一步研究。（3）NK 细胞的表观遗传修饰以及衰老个体NK 细胞表型的变化对CNS 疾病的影响尚缺乏完善的证据。（4）异体NK 细胞工程化扩增、基因修饰和CNS 疾病临床应用安全性，需要建立健全的政策和行业规范等。