钛表面不同硅烷偶联c（RGDfK）环肽的表征及生物相容性分析

钛的骨结合能力与表面结构和化学组成密切相关，对钛金属进行表面处理及负载涂层，可改变钛表面的微观结构和化学组成，从而提高细胞早期黏附和成骨分化水平

。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）多肽是一种有效且常用的刺激细胞黏附的肽序列，被发现能促进成骨细胞的生长，促使骨组织再生

。以往研究中，学者以硅烷偶联的方式形成了钛-硅烷-RGD 多肽的三层结构，证实可以促进细胞黏附、增殖以及成骨分化

。硅烷种类繁多，尤其是末端基团的不同可能给硅烷提供不同的化学活性，然而尚未见研究对比钛表面以不同末端基团的硅烷偶联RGD 多肽的效率及所实现的细胞活性。本研究使用氨基、巯基、氯基、烯酰氧基4 种不同末端的硅烷，即3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）、3-氯丙基三乙氧基硅烷（3-chloropro-pyltriethoxysilane，CPTES）、3-巯基丙基三甲氧基硅烷（3-mercaptopropyltriethoxysilane，MPTS）、3-异丁烯酰氧丙基三甲氧基硅烷（γ-methacryloxypropyltrimethoxysilane，γ-MPS）作为偶联剂将c(RGDfK)环肽固定于钛表面，对各组的化学结合进行表征分析，并对比其对MC3T3-E1 细胞黏附、增殖及分化的影响。

最近，绍兴市经济和信息化委员会公布了2018年绍兴市“隐形冠军”企业名单，浙江力普粉碎设备有限公司榜上有名。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

小鼠前成骨细胞MC3T3-E1 细胞（中国科学院细胞库，中国），钛片（陕西盛辉钛业有限公司，中国），APTES、CPTES、MPTS、γ-MPS（麦克林，中国），c（RGDfK）（合肥国肽生物科技有限公司，中国），磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）（白鲨，中国），胎牛血清（Cell Sciences，美国），青霉素/链霉素溶液（Gibco，美国），α-MEM（α-minimum essential medium，α-MEM）培养基（Gibco，美国），4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI）（Apexbio，美国），鬼笔环肽（Apexbio，美国），CCK-8 试剂盒（Dojindo Molecular Technology，Kumamoto，日本），碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）检测试剂盒（南京建成，中国），BCA（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白质浓度测定试剂盒（碧云天，中国），接触角计（SL250，Kino Industry，Boston，MA，美国），X 射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）（Escalab 250xi，Thermo Fisher Scientific，美国），扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）（MAIA3 TESCAN，捷克），激光共聚焦扫描显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）（LSM 780，CalZeiss AG，德国），酶标仪（PerkinElmer，Waltham，MA，美国）。

1.2 涂层制备方法

加工24 枚直径30 mm、厚1 mm 的圆形钛片以及48 枚直径5 mm、厚1 mm 的圆形钛片。所有钛片用400 目、800 目、1 200 目、2 000 目研磨用碳化硅纸依次进行机械抛光。抛光后，用丙酮、乙醇和超纯水依次超声清洗15 min，60 ℃烘干后置于干燥皿中保持干燥。

钛片分组处理（直径30 mm 钛片每组4 个，直径5 mm 钛片每组8 个）：①NT 组，钛片表面不做处理，空白对照组；②OH 组，碱热处理，即10 mL 60 ℃的5 mol/L NaOH 溶液中浸泡24 h，超纯水冲洗两遍，37 ℃干燥

；③OHAP 组，碱热处理后，在50 mL 5%APTES 的无水乙醇溶液中常温避光浸泡24 h，随后取出，无水乙醇中超声清洗15 min 以去除物理吸附的硅烷颗粒，37 ℃干燥，在110 ℃下固化1 h

；④OHCP 组，碱热处理，使用CPTES 与OHAP组同法做硅烷化处理；⑤OHMPT 组，碱热处理，使用MPTS与OHAP组同法做硅烷化处理，硅烷处理后在1%戊二醛溶液中浸泡1 h，超纯水冲洗，37 ℃干燥；⑥OHMPS 组，碱热处理，使用γ-MPS 与OHAP 组同法做硅烷化处理。上述OHAP、OHCP、OHMPT、OHMPS 组钛片分别处理后，高压蒸汽灭菌，然后浸入4 ℃的0.1 mg/mL c（RGDfK）肽/PBS 溶液中15 h，取出后PBS 清洗，常温干燥。细胞培养之前，所有样本均紫外消毒，并用PBS 冲洗。

1.3 表面处理的表征分析

1.3.1 表面润湿性能 各组随机选取直径30 mm钛片1 枚，以1 μL 去离子水为检测液，使用接触角计测量中心点的接触角。

1.3.2 X 射线光电子能谱（XPS）分析 随机选取直径5 mm 钛片1 枚，XPS 评估表面硅烷化及c（RGDfK）连接情况。在225 W 下用单色AlKa 辐照（1 486.7 eV）进行测量，入射角为90°。使用XPSPEAK41 软件进行光谱分析，评估Si2p、Cl2p、C1s、N1s、titanium2p、O1s 的强度。

激光共聚焦扫描显微镜观察6 组钛试件与MC3T3-E1 细胞共培养6 h 后的细胞黏附情况（图4），可见NT 组细胞铺展不佳，呈长梭形，未观察到明显的细胞伪足。OH 组、OHAP 组、OHCP 组、OHMPT 组、OHMPS 组细胞铺展呈圆形，见较多细胞微丝；其中，OHAP 组的钛片细胞铺展最好，伪足伸展最为充分。

1.4 细胞行为

根据酰胺-N/Ti 元素比，OHMPS 组负载c（RGD）fK 环肽稍高于OHCP 组及OHMPT 组，但远未达到该组硅烷负载率的优势，OHAP 组结合的c（RGD）fK 含量最少。

1.4.2 细胞黏附试验 将直径为5 mm 的钛片样品置于96 孔板中，每组1 个，以3 000 个/孔的密度接种细胞。培养6 h 后，将黏附在钛片表面的细胞用4%多聚甲醛固定20 min，然后在室温下用0.5%Triton X-100 在PBS 中通透15 min，用DAPI 对细胞核进行染色，用鬼笔环肽对细胞骨架进行染色。使用CLSM 观察细胞形态。

1.4.3 细胞增殖试验 将直径为5 mm 的钛片样品置于96 孔板中，每组5 个，以3 000 个/孔的密度接种细胞。培养7 d 后使用CCK-8 试剂盒检测细胞增殖率。使用酶标仪测量450 nm 处的吸光度值。以含有CCK-8溶液但没有接种细胞的孔为空白对照。

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增殖率（%）＝（各实验组吸光度平均值-空白孔吸光度平均值）/（无材料只有细胞组吸光度平均值-空白孔吸光度平均值）× 100%

使用SPSS 22，对上述接触角测量、细胞增殖、ALP 活性检测实验数据进行分析，在方差齐性条件下采用单因素方差分析和LSD-

检验来评估组间差异，以

＜0.05 为差异具有统计学意义。

1.5 统计学分析

1.4.4 ALP 活性检测 将直径为30 mm 的钛片样品置于6 孔板中，每组3 个，以8 × 10

个/孔的密度接种细胞，7 d 后，使用ALP 检测试剂盒检测ALP 活性，并使用BCA 蛋白质浓度测定试剂盒检测的蛋白总量作为标准。

OHAP、OHCP、OHMPS 组N 元素峰呈现出两种组分，为399.8～400.2 eV 及401～402 eV，分别对应蛋白质中酰胺键和伯胺

，各组中酰胺键的含量为83%～88%，而OHMPT 组N 元素中均为酰胺键成分（图3）。

2 结 果

2.1 处理表面的表征分析

SEM 观察显示，抛光的钛片呈光滑表面，碱热处理在钛片表面形成了海绵状三维立体网状结构，孔径大小约为100～200 nm，接枝各种硅烷及c（RGDfK）环肽使部分孔隙被填满（图1）。

XPS 结果显示，碱热处理后钛表面O 元素增加，证明活化后大量羟基成功负载于钛表面，负载硅烷及c（RGDfK）环肽后Si、N 元素含量增加，提示硅烷及多肽的有效连接（表1）。Si/Ti 值结果提示OHMPS 组硅烷的负载量相对于其他三种硅烷高数倍，提示γ-MPS 与活化后钛表面的结合能力最强。

1) 当r=2时,由定理5知，Pn满足二阶常系数齐次线性差分方程相应的特征方程为特征根为由引理2得差分方程的通解为

接触角测量结果显示，抛光的钛片接触角超过90°，提示并非亲水性表面；碱热处理后的多孔结构使接触角急剧降低，呈现极亲水的状态；而进一步接枝硅烷及多肽后，各组水接触角则均有不同程度的回升，其中OHMPS 组的接触角回升最多（

＝0.142；OHAP 组：

＜0.05；OHCP 组：

＜0.05；OHMPT 组：

＜0.05；OHMPS 组：

＜0.05）（图2）。

深圳港在2014年率先出台“绿色航运”补贴政策，对于使用低硫油的船舶每年补贴2亿元人民币。其中，船舶使用硫含量0.1%～0.5%m/m燃油，政府补贴低硫油和重油差价的75%；船舶使用硫含量≤0.1%m/m燃油，政府补贴低硫油和重油差价的100%。政策出台以来，深圳“绿色港口”建设成效显著。截至2017年6月底，深圳港已有7643艘次远洋船舶靠泊期间使用低硫燃油，减排硫氧化物约2873.9吨，减排氮氧化物约230.3吨，减排PM2.5污染物约273.7吨。

1.4.1 细胞培养 将小鼠前成骨细胞MC3T3-E1 细胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素溶液的α-MEM 培养基中，置于37 ℃含5% CO

的培养箱中培养。检测ALP 活性时，细胞在添加50 μg/mL抗坏血酸、10 Mm β-甘油磷酸盐和10nM 地塞米松的上述培养基中孵育以诱导成骨分化。

2.2 细胞黏附性比较

1.3.3 表面形貌 每组挑选1 枚直径5 mm 钛片喷金，SEM 在二次电子模式下观察，工作电压20 kV，工作距离（5.425 ± 0.5）mm。

2.3 细胞增殖情况比较

MC3T3-E1 细胞与钛试件共培养7 d 后，OHAP、OHMPT、OHMPS 组均显示出良好的增殖潜力，与NT 组相比有显著差异（

＝0.089；OHAP 组：

＝0.013；OHMPT 组：

＝0.002；OHMPS 组：

＝0.025）（图5）。OHMPT 组增殖活性最好。OH 组和OHCP 组与NT 组相比，差异无统计学意义（OH 组：

＝0.934；OHCP 组：

＝0.139）。

2.4 细胞成骨活性比较

各组钛片表面接种MC3T3-E1 细胞并进行成骨诱导7 d 的ALP 活性如图6 所示，可以发现各种硅烷-c（RGDfK）环肽处理组均促进了细胞ALP 的表达，其中，OHAP、OHMPT、OHMPS 组的相对表达量较高，与NT 组相比差异有统计学意义（

＝0.051，OHAP 组：

＝0.002；OHMPT 组：

＝0.007；OHMPS 组：

＝0.001），而OH 组、OHCP 组较NT 组差异没有统计学意义（OH 组：

＝0.173，OHCP 组：

＝0.167）。

3 讨 论

RGD 多肽是生物材料领域中研究最为广泛的功能性多肽之一，其在纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等多种细胞外基质蛋白中检测出，且证实其能与细胞膜上多种整合素特异性识别，是人体内广泛存在并使用的肽序列

。在许多实验中，RGD 多肽在促进多种细胞类型与不同材料的结合方面有效，目前RGD 多肽在研究中的应用主要在于和多种活性物质共同作用、改善材料表面生物性能，也有研究将其用于靶向药物载体的制备。人工合成的环肽较线肽有更好的抗酶解能力和热稳定性，应用前景更广

。

对材料进行表面活化，运用偶联剂改性，进而负载多肽涂层是将多肽结合于钛表面的常用方法

。本研究中，首先按照文献［7］中的方法，对钛表面进行碱热处理，强碱对钛的腐蚀作用使得钛表面形成亚微米级三维网状结构的孔洞，可以提高金属表面润湿性。DAPI 及鬼笔环肽染色后激光共聚焦显微镜下观察证实碱热处理也可以一定程度改善材料表面的细胞黏附。碱热处理还使钛表面负载了大量羟基，为利用硅烷偶联剂进一步进行表面改性提供了化学基础

。硅烷中的甲氧基或乙氧基水解后，可与碱热活化表面上的羟基发生缩聚反应，形成Ti-O-Si 键，彼此之间在加热后也可形成Si-O-Si 键，进一步稳定连接

。本实验中，可能由于碱热处理后部分孔隙较大，负载硅烷后呈现出部分孔隙被填满、部分孔隙未能填满的不完整的膜结构，这可能对硅烷涂层的强度有所影响，但碱热处理后的亚微米结构得以保留。考虑到c（RGDfK）仅是由五个氨基酸组成的环肽，分子量较小，其与硅烷结合后难以通过扫描电镜观察到其结构，填满孔隙的结构主要是聚合后的硅烷。其中，各组之间的孔隙填满的形态略有不同，这可能和不同末端基团的硅烷在钛表面的聚合方式差异有关。

硅烷的另一端为活性基团，可与c（RGDfK）反应。OHAP 组中，主要依靠氨基与c（RGDfK）中羧基的静电相互作用以及碱热处理后的表面多孔形貌将其固定；MPTS 组中，巯基与戊二醛的一侧醛基反应生成C-S 键，另一侧醛基与c（RGDfK）的氨基反应生成席夫碱

；CPTES 组中，来自CPTES 有机官能团的氯原子是反应的亲电中心，c（RGDfK）中非结合部位的游离胺基是亲核基团，氯原子可以直接和氨基发生亲核取代反应

；而γ-MPS 中的烯酰氧基可以和氨基发生氮杂Michael 加成反应，乙烯基的双键打开，通过C-N 键相连。

XPS 结果证明c（RGDfK）结合于材料表面。本研究发现，MPTS、γ-MPS、CPTES 均结合了较多的c（RGDfK），其生物学性能较处理前有所改善，OHMPS 组负载c（RGDfK）环肽稍高于OHCP 组及OHMPT 组，但远未达到该组硅烷负载率的优势，可能是由于在温和环境下γ-MPS 与c（RGDfK）反应不活泼。而APTES 修饰后的钛表面虽然固定的c（RGDfK）不多，但对细胞黏附性能的改善较γ-MPS 组反而更好。此前有学者认为，人工合成RGD 多肽的促黏附效果与天然的有大量结合域蛋白相比较弱，在暴露于血清等有大量天然蛋白的溶液时，由于天然蛋白引发的信号传导，表面修饰的RGD 多肽对细胞黏附的影响并不明显

。

当孩子就诊用药物后，需要耐心等待药物发挥作用，因为药物在血液中达到一定浓度的时候才能发挥作用。不建议家长反复去医院就诊，重复用药，叠加用药，致使药物在孩子体内蓄积，引发不良反应；或者不等药物发挥作用就停药而换另一种药物。频繁换药反而容易造成疾病迁延不愈，尤其是一些细菌感染的疾病，使细菌产生耐药性。

本研究中，除OHCP 组外，硅烷偶联c（RGDfK）处理后，细胞增殖和成骨分化活性均增强，OHMPT组、OHMPS 组、OHAP 组间没有显著差别。OHAP组虽然结合的c（RGDfK）较少，但其表面未反应的硅烷末端在溶液中可水解为带正电荷的NH

，这有利于蛋白质的吸附，从而促进细胞黏附、增殖和成骨分化

。而OHCP 组表面残留的硅烷末端水解后为带负电的Cl

，这可以部分解释该组生物学性能不佳的问题。

(3)回热系统优化成果显示，随着机组负荷率的下降，汽轮机热耗和供电煤耗下降值随之扩大，说明基于0号高压加热器的回热系统适合大容量高参数机组的调峰需求。

基于以上分析，可以得出以下结论：MPTS、CPTES、γ-MPS 三种硅烷能够作为偶联剂将c（RGDfK）环肽结合于钛表面，提供促进成骨细胞黏附、增殖和分化的作用，其中γ-MPS 偶联c（RGDfK）环肽的效果最好，而MPTS、CPTES、γ-MPS 连接c（RGDfK）环肽后具有相似的生物学性能。

赛十娘说着就哽咽起来，眼泪直往下掉。缓了一会儿，又接着说：“飞机走远了，我翻过身，见我妈身上都是血，后背掀掉了一大块。我妈当时还冇断气，她拉着我的手，流着泪说，娘再也护不了你了……你已经十六了，娘是真想看着你成家啊……”

另外，“吃禁果”是男女之情的隐喻，摩西说得过于委婉，可人们还是猜得出来，繁衍后代就等于生生不息，永远不死了。

【Author contributions】 Zhou QY designed the study，analyzed the data，wrote the article. Hong GY，Wu T assisted the performing of the experiments. Chen C，Xie HF designed the study and revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

[1]Chrcanovic BR, Kisch J, Albrektsson T, et al. A retrospective study on clinical and radiological outcomes of oral implants in patients followed up for a minimum of 20 years[J].Clin Implant Dent Relat Res,2018,20(2):199-207.doi:10.1111/cid.12571.

[2]Smeets R, Stadlinger B, Schwarz F, et al. Impact of dental implant surface modifications on osseointegration[J]. Biomed Res Int,2016:6285620.doi:10.1155/2016/6285620.

[3]Bellis SL. Advantages of RGD peptides for directing cell association with biomaterials[J]. Biomaterials, 2011, 32(18): 4205-4210.doi:10.1016/j.biomaterials.2011.02.029.

[4]Chen X, Sevilla P, Aparicio C. Surface biofunctionalization by covalent co-immobilization of oligopeptides[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2013,107:189-197.doi:10.1016/j.colsurfb.2013.02.005.

[5]Chen WC, Ko CL. Roughened titanium surfaces with silane and further RGD peptide modification

[J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2013, 33(5): 2713-2722. doi: 10.1016/j.msec.2013.02.040.

[6]Paredes V, Salvagni E, Rodríguez-Castellon E, et al. Study on the use of 3-aminopropyltriethoxysilane and 3-chloropropyltriethoxysilane to surface biochemical modification of a novel low elastic modulus Ti-Nb-Hf alloy[J]. J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2015,103(3):495-502.doi:10.1002/jbm.b.33226.

[7]Yang Z,Xi Y,Bai J,et al.Covalent grafting of hyperbranched poly-L-lysine on Ti-based implants achieves dual functions of antibacteria and promoted osteointegration

[J]. Biomaterials, 2021,269:120534.doi:10.1016/j.biomaterials.2020.120534.

[8]Hersel U, Dahmen C, Kessler H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond[J]. Biomaterials,2003,24(24):4385-4415.doi:10.1016/s0142-9612(03)00343-0.

[9]Hautanen A, Gailit J, Mann DM, et al. Effects of modifications of the RGD sequence and its context on recognition by the fibronectin receptor[J].J Biol Chem,1989,264(3):1437-1442.

[10] Heller M, Kumar VV, Pabst A, et al. Osseous response on linear and cyclic RGD-peptides immobilized on titanium surfaces

and

[J]. J Biomed Mater Res A, 2018, 106(2): 419-427.doi:10.1002/jbm.a.36255.

[11] Yu X, Xu R, Zhang Z, et al. Different cell and tissue behavior of micro-/nano-tubes and micro-/nano-nets topographies on selective laser melting titanium to enhance osseointegration[J]. Int J Nanomedicine,2021,16:3329-3342.doi:10.2147/IJN.S303770.

[12] Meroni D, Lo Presti L, Di Liberto G, et al. A close look at the structure of the TiO2-APTES interface in hybrid nanomaterials and its degradation pathway:an experimental and theoretical study[J]. J Phys Chem C Nanomater Interfaces, 2017, 121(1): 430-440.doi:10.1021/acs.jpcc.6b10720.

[13] Ryu JJ,Park K,Kim H,et al.Effects of anodized titanium with Arg-Gly-Asp(RGD)peptide immobilized

chemical grafting or physical adsorption on bone cell adhesion and differentiation[J]. Int J Oral Maxillofac Implants, 2013, 28(4): 963-972. doi: 10.11607/jomi.2421.

[14] Senna PM,de Almeida BC,Mello-Machado RC,et al.Silane-coating strategy for titanium functionalization does not impair osteogenesis

[J]. Materials (Basel), 2021, 14(7): 1814. doi:10.3390/ma14071814.

[15] Hao L, Li T, Wang L, et al. Mechanistic insights into the adsorption and bioactivity of fibronectin on surfaces with varying chemistries by a combination of experimental strategies and molecular simulations[J]. Bioact Mater, 2021, 6(10): 3125 - 3135. doi:10.1016/j.bioactmat.2021.02.021.

[16] Arima Y, Iwata H. Preferential adsorption of cell adhesive proteins from complex media on self-assembled monolayers and its effect on subsequent cell adhesion[J]. Acta Biomater, 2015, 26: 72-81.doi:10.1016/j.actbio.2015.08.033.

[17] Lee MH, Boettiger D, Ducheyne P, et al. Self-assembled monolayers of omega-functional silanes:a platform for understanding cellular adhesion at the molecular level[M]. Leiden: Brill Academic Publishers,2007:82.