低磷胁迫对大花序桉幼苗叶片生理指标的影响

何榜眼，刘世男，杨 梅，梁喜献，2

(1.广西大学林学院，南宁 530004；2.广西大学行健文理学院，南宁 530004)

【研究意义】磷作为植物生长必需的元素之一，不仅是植物体内生物膜、核酸及腺苷三磷酸(ATP)等多种物质的组成成分，还参与植物的呼吸作用、光合作用和信号传导等代谢过程，对植物的生长发育具有重要作用[1-3]。已有研究表明，植物可利用的磷主要为土壤中的有效磷，当土壤有效磷不足时，植物在其生理生化方面会发生明显变化，正常生长发育受到影响，但植物也会主动发挥自身的调节能力适应逆境，以增加其完成生命周期的机会[4-5]。大花序桉(EucalyptuscloezianaF.Muell)是我国南方重要的实木用材树种[6]，被广泛应用于建筑、工矿、家具及坑木等[7-8]。在我国南方地区，土壤胶体含有大量氢离子和铝离子，土质黏重，通透性差，其有效磷严重缺乏[4，9]，所栽培的大花序桉苗木生长速度缓慢，容易出现植株矮小等不良现象。土壤缺磷已成为限制大花序桉产量的主要因素之一。因此，探究低磷胁迫对大花序桉幼苗叶片生理指标的影响，对大花序桉幼苗的抗低磷机制研究及推广栽培具有重要意义。【前人研究进展】低磷胁迫下植物体内的保护酶活性、光合色素含量和叶绿素荧光参数等生理指标会发生相应的变化，可反映植物对低磷胁迫的抗性[10-11]。叶思诚[12]研究表明，低磷胁迫会对油茶(Camelliaoleifera)叶片造成损害，使其叶绿素含量、最大光化学量子效率(Fv/Fm)和实际光化学效率(ΦPSⅡ)下降，但油茶叶片会通过提升体内保护酶活性来保护其机体。高乐等[13]研究表明，低磷胁迫可提高橡胶(Heveabrasiliensis)叶片丙二醛(MDA)含量，引起叶片膜脂过氧化，而通过提升过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性可缓解橡胶叶片的膜脂过氧化，这是其对低磷胁迫的一种适应性反应。陈凯[14]研究也发现，山白兰(Paramicheliabaillonii)叶片的MDA含量会随着磷浓度的降低而增加，而通过提升SOD和过氧化物酶(POD)活性可减少低磷胁迫对其机体造成的伤害，但重度胁迫下其SOD活性会遭受抑制，表明山白兰对低磷胁迫的适应性存在一定限度。袁继存等[15]研究发现，当磷浓度低于1.0 mmol/L时，苹果(MaluspumilaMill.)叶片的叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)和类胡萝卜素(Caro)含量显著降低。王阳等[16]研究也发现，当磷肥施用量低于30 g/株时，核桃(JuglansregiaL.)各光合色素的含量显著降低。袁继存等[17]研究不同磷浓度水平对梨(Pyrusspp.)叶片生理的影响，发现梨叶片初始荧光(Fo)、最大荧光(Fm)、可变荧光(Fv)及Chl a、Chl b和Caro含量在一定范围内会随着磷浓度的升高而增加，并在磷浓度为1.5 mmol/L时达到最大值，比缺磷处理(0 mmol/L)分别提高9.04%、9.49%、9.57%、42.7%、60.9%和37.8%，表明供磷不足时梨叶片光合作用受到显著抑制。【本研究切入点】目前，国内外对大花序桉的研究主要围绕遗传选育[18-19]、组培快繁[20-21]、营林抚育[22]和木材性质[23]等展开，有关低磷胁迫对大花序桉叶片生理指标影响的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】以大花序桉无性系1203号和1212号幼苗为试验材料，测定低磷胁迫后其叶片的保护酶活性、光合色素含量和叶绿素荧光参数等指标，探究低磷胁迫对大花序桉叶片生理指标的影响，为大花序桉的抗低磷机制研究及其苗木的推广种植提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试大花序桉为生产上常用的2个优良无性系1203号和1212号10个月苗龄组培苗。幼苗平均株高(30.0±3.2)cm，平均地径(2.41±0.3)mm，生长健壮，无机械损伤和病虫害。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 2019年11月6日，将从市场上购回的大花序桉幼苗统一用去离子水洗净根际土壤，在广西大学林学院苗圃温室大棚中进行水培。以1/2 Hoagland营养液为组培苗提供营养，以KH2PO4作为处理磷源，参照Fanghua等[24]的方法设置2个磷浓度处理，分别为低磷(0.1 mmol/L)和正常磷(1.0 mmol/L)，并以KCl平衡不同处理中的K+浓度差异。采用完全随机设计，每处理培养3盆(3个重复)，每盆培养10株，所有处理共培养120株。每3 d更换1次培养液，利用充气泵24 h充氧，以保证大花序桉幼苗根系有良好的通气状况。培养至2019年11月27日，进行幼苗叶绿素荧光参数测定；次日7：00—9：00用剪刀剪取生长位置和成熟度一致的大花序桉幼苗鲜叶，洗净后用冰袋保存，迅速带回实验室，进行其他指标测定。

1.2.2 测定指标及方法 保护酶活性及MDA含量测定：SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)法[25]测定，多酚氧化酶(PPO)活性采用邻苯二酚法[26]测定，POD和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性分别用愈创木酚法和紫外吸收法测定[27]；MDA含量以硫代巴比妥酸法[28]进行测定。

光合色素含量测定：叶绿素和Caro含量参照熊庆娥[29]的方法进行测定，使用95%酒精避光浸提叶片24 h后，分别在665、649、470 nm波长下测定浸提液的吸光度，进而计算Chl a、Chl b和Caro含量。

叶绿素荧光参数测定：采用便携式叶绿素荧光仪PAM-2500测定叶片PSⅡ初始荧光(Fo)和最大荧光(Fm)原始参数，再计算其他参数。测定Fo和Fm时，提前将大花序桉幼苗暗适应30 min。各叶绿素荧光参数计算公式：Fv=Fm-Fo；最大光化学效率(Fv/Fm)=(Fm-Fo)/Fm；实际光化学效率(ΦPSⅡ)=(Fm′-F)/Fm；非光化学淬灭系数(NPQ)=(Fm-Fm′)/Fm′。式中，Fm′为叶片未经过暗适应所测得的最大荧光，F为任意时间的实际荧光产量。

1.3 统计分析

采用Excel 2019进行数据统计和制图，以SPSS 24.0进行单因素方差分析(ANOVA)，以Duncan’s新复极差法分析不同处理间的差异显著性，以Pearson相关系数分析各指标间的相关性。

2 结果与分析

2.1 低磷胁迫对大花序桉幼苗叶片保护酶活性及MDA含量的影响

从图1可看出，低磷处理大花序桉无性系1203号和1212号幼苗叶片的SOD活性分别为18.42和16.25 U/g FW，PPO活性分别为894.13和1138.00 U/g FW，POD活性分别为579.67和471.33 U/gFW，APX活性分别为1598.89和688.33 U/g FW，均显著高于正常磷处理(P<0.05，下同)。其中，低磷处理无性系1203号幼苗叶片的SOD、PPO、POD和APX活性升幅分别为25.82%、22.73%、6.60%和8.64%，无性系1212号幼苗叶片的SOD、PPO、POD和APX活性升幅分别为57.16%、6.14%、42.43%和64.32%。说明低磷胁迫会引起大花序桉无性系幼苗叶片的保护酶活性显著升高，其中无性系1212号幼苗叶片的SOD、PPO和APX活性升幅大于无性系1203号，而POD活性升幅小于无性系1203号。

同一小图图柱上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同Different lowercase letters on the histogram indicated a significant difference(P<0.05)，the same as below图1 大花序桉2个无性系幼苗叶片的各保护酶活性对比Fig.1 Comparison of protective enzyme activities in leaves of two clones of E. coleziana

从图2可看出，低磷处理大花序桉无性系1203号和1212号幼苗叶片的MDA含量分别为0.0032和0.0037 μmol/g FW，均较正常磷处理显著提高。其中，低磷处理无性系1203号幼苗叶片的MDA含量比正常磷处理提高21.89%，无性系1212号幼苗叶片的MDA含量比正常磷处理提高15.63%。说明低磷胁迫会引起大花序桉无性系幼苗叶片的MDA含量显著提高，其中无性系1212号叶片MDA含量的提高幅度小于无性系1203号。

图2 大花序桉2个无性系幼苗叶片的MDA含量对比Fig.2 Comparison of MDA content in leaves of two clones of E.coleziana

2.2 低磷胁迫对大花序桉幼苗叶片光合色素含量的影响

在低磷处理下，大花序桉无性系1203号和1212号幼苗叶片的Chl a含量分别为1.10和1.01mg/g，Chl b含量分别为0.55和0.50 mg/g，叶绿素总量分别为1.65和1.51 mg/g，Caro含量分别为0.17和0.12 mg/g，均较正常磷处理低(图3)。其中，低磷处理无性系1203号幼苗叶片的Chl a、Chl b、叶绿素总量和Caro含量均较正常磷处理显著下降，降幅分别为9.84%、15.38%、11.76%和26.09%，无性系1212号幼苗叶片的Chl a、Chl b和叶绿素总量较正常磷处理无显著差异(P>0.05)，Caro含量下降显著，降幅分别为5.61%、9.09%、5.16%和20.00%。说明在低磷胁迫下，2个大花序桉无性系幼苗叶片光合色素的合成均受到抑制，但无性系1212号受到抑制的程度较小。

图3 大花序桉2个无性系幼苗叶片的各光合色素含量对比Fig.3 Comparison of photosynthetic pigment content in leaves of two clones of E.coleziana

2.3 低磷胁迫对大花序桉幼苗叶绿素荧光参数的影响

从表1可看出，相较正常磷处理，低磷处理下大花序桉2个无性系幼苗的Fo和NPQ均上升，Fm、Fv、Fv/Fm和ΦPSⅡ均明显下降。其中，低磷处理无性系1203号幼苗的Fo和NPQ分别为0.082和1.44，较正常磷处理分别上升6.0%和71.43%，Fm、Fv、Fv/Fm和ΦPSⅡ分别为0.37、0.29、0.78和0.31，较正常磷处理分别下降17.78%、21.61%、6.02%和16.22%，但仅Fo的变化未达显著水平；低磷处理无性系1212号苗木的Fo和NPQ分别为0.082和1.35，较正常磷处理分别上升4.8%和45.16%，Fm、Fv、Fv/Fm和ΦPSⅡ分别为0.40、0.31、0.79和0.32，较正常磷处理分别下降9.09%、13.89%、3.66%和11.11%，但仅NPQ的变化达显著水平。说明低磷胁迫对2个无性系苗木叶片的光合机构均造成损伤，而NPQ上升说明其叶片光合机构对低磷胁迫作出了应对，以减轻其损伤程度。

表1 大花序桉2个无性系幼苗叶片各叶绿素荧光参数对比

2.4 磷浓度与大花序桉安幼苗叶片各生理指标及各生理指标之间的相关分析

由表2可看出，磷浓度与Fv、Fv/Fm和ΦPSⅡ呈显著正相关，与Fo和NPQ呈显著负相关；PPO活性与Chl a和Caro含量呈显著负相关，与MDA含量高度正相关且与Chl a、Chl b及Caro含量高度负相关(|r|>0.8)；MDA含量与Chl a和Caro含量呈显著负相关，与Chl b含量呈极显著负相关(P<0.01，下同)；3种光合色素两两之间均呈显著正相关；Fo与Fv和Fv/Fm呈显著负相关，与ΦPSⅡ呈极显著负相关，与NPQ呈极显著正相关；Fm与Fv呈极显著正相关，与Fv/Fm和ΦPSⅡ呈显著正相关，与NPQ呈显著负相关；Fv与Fv/Fm、ΦPSⅡ呈极显著正相关，与NPQ呈极显著负相关；Fv/Fm与ΦPSⅡ呈极显著正相关，与NPQ呈极显著负相关；ΦPSⅡ与NPQ呈极显著负相关。总体而言，磷浓度与各保护酶活性、MDA和光合色素含量间存在一定的相关性，但均未达显著水平，而与大部分叶绿素荧光参数间呈显著相关，说明低磷胁迫对大花序桉苗木各生理指标存在不同程度的影响，其中，对叶绿素荧光参数的影响最大。

表2 磷浓度与大花序桉幼苗叶片各生理指标及各生理指标间的相关分析结果

3 讨 论

在正常情况下，植物细胞内氧自由基的产生与清除处于动态平衡状态，当遭受逆境时，这种平衡会被打破，造成氧自由基含量上升，对植物膜系统造成伤害[30]。MDA是植物细胞膜脂过氧化的产物之一，会严重损害生物膜，其含量的变化能在一定程度上反映植株的自我修复能力，因此常用于评价植物对逆境的反应能力[31]。本研究发现，低磷处理下两个大花序桉幼苗无性系叶片的MDA含量均升高，表明低磷胁迫对大花序桉幼苗造成了损害。为了减轻伤害程度，其体内的保护酶系统被激活，叶片SOD、PPO、POD和APX活性明显增强，因此，大花序桉幼苗能快速清除其体内增多的自由基，恢复原来的动态平衡，与杉木(Cunninghamialanceolata)和赤皮青冈(Cyclobalanopsisgilva)在低磷下的表现较一致[32-33]。

光合色素是植物将无机物转变成有机物的关键介质，其含量的变化对植物光合作用具有很大影响，在一定程度上影响植株的正常生长和抗逆性[34]。乔光等[35]对马尾松(Pinusmassoniana)、裘珍飞等[36]对黑木相思(Acaciamelanoxylon)研究发现，低磷胁迫可使总叶绿素含量下降，但对类胡萝卜素含量的影响较小。本研究中，低磷处理会引起大花序桉苗木叶片的Chl a、Chl b和Caro含量下降，与乔光等[35]对马尾松、裘珍飞等[36]对黑木相思的研究结果一致。说明低磷处理阻碍了大花序桉苗木光合色素的合成，推测可能与低磷处理下其光合组织受损有关。

植物体的叶绿素荧光参数对逆境十分敏感，可以提供植物耐胁迫性和光系统损害程度等有用信息[37]。NPQ是植物为防止光合机构受到损害所形成的一种自我保护机制[38]，当植物遭受严重胁迫时会明显提升[39]。本研究中，供试的2个大花序桉无性系受低磷胁迫影响，Fo均上升，说明二者的PSⅡ反应中心已经受到损害；Fm、Fv、Fv/Fm和ΦPSⅡ下降，说明二者PSⅡ反应中心的电子传递、QA的氧化还原和光能转换等均受到了阻碍；而NPQ均上升，说明大花序桉对低磷逆境作出了响应，以减少PSⅡ反应中心进一步损伤。

低磷胁迫下植物叶片各生理指标的变化存在一定的相关性，通过相关性分析可获知其关联程度。陈雯彬等[10]研究表明，低磷胁迫下赤皮青冈叶片MDA含量与POD和SOD活性呈极显著正相关。陈健晓[40]等研究发现，水稻(OryzasativaL.)在低磷胁迫下叶片各叶绿素荧光参数间存在显著相关关系。本研究中，大花序桉叶片6个叶绿素荧光参数均与磷浓度呈高度相关，其中仅Fm与磷浓度无显著相关性，说明低磷胁迫易引起大花序桉叶片Fo、Fm、Fv、Fv/Fm和ΦPSⅡ异常，造成叶片PSⅡ反应中心损伤，而通过提升NPQ是大花序桉减少叶片损害的重要手段；MDA含量与Chl a、Chl b和Caro含量均呈显著负相关，说明低磷胁迫引起MDA含量的积累对大花序桉叶片生物膜系统造成了不可逆的损伤，从而影响其叶片光合色素的合成；PPO活性与MDA含量高度正相关且与Chl a、Chl b及Caro含量高度负相关，说明在叶片光合组织受损时，PPO的敏感性极高，在大花序桉保护叶片光合组织的过程中发挥着极大作用。此外，6个叶绿素荧光参数中，除Fo与Fm的相关性未达显著水平外，其余参数两两间均呈显著相关，说明大花序桉苗木叶片光系统的各项功能存在密切联系，在受到低磷胁迫时，其功能的完整性会受到明显影响。因此，在生产实践中可将叶片保护酶活性、光合色素含量和叶绿素荧光参数作为检测大花序桉幼苗磷素营养状况的指标，并注意适时对大花序桉幼苗施用磷肥。

4 结 论

低磷胁迫使大花序桉苗木叶片大量积累MDA，导致叶片组织受到不可逆损伤，进而引起叶片光合机构功能异常；但大花序桉苗木能通过对叶片SOD、PPO、POD和APX等保护酶和NPQ的综合调节来减轻低磷胁迫引起的伤害，尤其以PPO和NPQ的调节作用更佳，二者在减轻大花序桉苗木叶片损害过程中可能发挥着重要作用。