基于DNA条形码的向日葵田弯管列当种群遗传多样性研究

张毅笑 魏守辉 姜翠兰 黄兆峰 苏杰天 孟帅帅 云晓鹏 白全江 吴文龙 黄红娟

摘要 弯管列当是危害我国向日葵最严重的寄生杂草。为了明确我国向日葵田弯管列当种群的遗传多样性，本试验利用rbcL、matK、ITS2条形码序列对采自我国向日葵主产区的58份弯管列当样品进行PCR扩增及测序，采用Vector NTI软件对测序结果进行剪切比对，利用MEGA 6.0软件计算种内遗传距离并构建系统发育树。利用扫描电镜观察其种子的显微形态特征。结果表明，3个DNA 条形码序列中仅ITS2片段扩增测序结果理想并表现出较好的聚类结果。各样品ITS2序列剪切比对后长度为453 bp，种内遗传距离为0.002～0.007，通过比较各样品ITS2序列的碱基组成和差异位点，能将不同弯管列当种群区分开。ITS2聚类结果表明58份弯管列当样品聚为3类，分别为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。形态分类结果表明，不同类型弯管列当在植株形态、种子形状及微观形态结构等方面存在差别。由于不同弯管列当种群的生境、寄主（向日葵栽培品种）不同，其种群遗传进化差异显著。基于ITS2 条形码和扫描电镜形态学观察相结合的方法可用于弯管列当种群遗传多样性研究。

关键词 弯管列当; DNA条形码; ITS2序列; 种子形态; 遗传多样性

中图分类号： S453

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021039

Abstract Orobanche cernua Loefling is the most serious parasitic weed that threats the production of sunflower in China. To clarify the genetic diversity of different O.cernua populations in sunflower fields， barcode fragments of rbcL， matK and ITS2 were used for PCR amplification and sequencing of 58 samples of O.cernua collected from main sunflower-producing areas. The sequencing results were assembled using the Vector NTI software. MEGA 6.0 was used to calculate the intraspecific genetic distance and construct phylogenetic trees. The microscopic morphological characteristics of O.cernua seeds were observed by scanning electron microscope. The results showed that， among the three DNA barcodes， only the results of amplification and sequencing of ITS2 fragments were satisfactory and showed better clustering effect. The length of ITS2 sequences after shear alignment was 453 bp. The intraspecific genetic distance was 0.002-0.007. By comparing the base composition and differential sites of ITS2 sequences of each sample， different O.cernua populations could be distinguished. The clustering results of ITS2 showed that 58 samples of O.cernua were divided into three groups， which could be classified as type Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ. The results of morphological classification showed that there were differences in plant morphology， seed shape and micro-morphological structure among different types. There were significant differences in the population genetic evolution among different O.cernua populations originated from different habitats and hosts （sunflower cultivars）. The method based on ITS2 barcoding and morphological observation by scanning electron microscope could be used to study the population genetic diversity of O.cernua.

Key words Orobanche cernua; DNA barcoding; ITS2 sequence; seed morphology; genetic diversity

彎管列当Orobanche cernua Loefling是列当科Orobanchaceae列当属Orobanche的根部全寄生性杂草，广泛分布于世界各地。在我国主要分布在吉林、内蒙古、河北、山西、陕西、甘肃、青海和新疆等地，可寄生在向日葵根上对其产量和品质造成严重危害[14]。弯管列当被认为是起源于保加利亚，寄主为菊科Asteraceae蒿属Artemisia植物或禾谷类植物。20世纪50年代随着向日葵广泛种植、引种，其寄主发生适应性改变[5]。1957年弯管列当首次在我国河北省怀来县向日葵Helianthus annuus L.上被发现和报道[6]。近年来，由于向日葵播种面积不断扩大，该杂草已扩散至我国向日葵主要产区内蒙古、新疆等地[3]，严重阻碍了向日葵生产，被列为国家进境检疫性杂草[7]。由于弯管列当在中国分布范围广，不同地区向日葵种源复杂、生境不同，造成弯管列当遗传背景复杂且存在不同致病力生理小种的分化[810]，从而导致不同弯管列当种群的形态、遗传进化程度存在一定差异。在对我国向日葵田弯管列当的危害进行调查时发现，不同弯管列当种群形态上存在明显差别，主要表现在植株大小、花序形态和花朵数目等方面，但不同种群的致病力、生理小种以及之间的亲缘关系仍不清楚。而明确不同形态弯管列当种群遗传多样性及亲缘关系，对防治弯管列当和向日葵抗性育种具有重要的科学意义。

由于弯管列当在植株大小、花序长度、花萼裂片分裂度及花的颜色和大小等方面有变化，其命名较为混乱。根据《中国植物志》的描述，在《苏联植物志》和《内蒙古植物志》中，将弯管列当鉴定为O.cumana。实际上，O.cumana是O.cernua的一个变种，在《中国植物志》和《巴基斯坦植物志》中，已经将O.cumana及O.cernua var. cumana（Wallr.）G. Beck作为O.cernua的异名处理[11]。目前，这两个名字在文献中都有记载，因此有关其分类鉴定及遗传多样性分析至关重要。国内外已有从形态学、分子生物学、遗传多样性方面研究列当属植物分类鉴定的报道。王定国等[12]和Pujadas-Salvà等[13]采用形态学分类方法，通过植株外部形态特征和种子电镜扫描显微形态特征对O.cumana和O.cernua进行分类，结果表明二者亲缘关系较近，但在植株大小、花序形状、花朵数目以及种子显微形态特征等方面存在明显的区别。其中，O.cumana植株细高，穗状花序松散，有20～50朵花，花冠白色或者淡蓝色，种子形状不规则，种脐不明显，种皮表面有脊状突起的方形大网纹，网纹里有形状规则的小网眼;而O.cernua植株比O.cumana植株矮，花序较密集，有50～70朵花，花冠蓝色、深紫色或紫色，种子椭圆形，种脐明显，种皮表面有长方形大网纹，网纹里有形状不规则的小雕痕。Pineda-Martos等[14]利用共显性SSR分子标记研究了西班牙向日葵田O.cumana群体的遗传多样性，结果表明在同一种群中同时存在两个基因库，并且它们之间发生了基因重组。远缘基因库之间的基因重组是产生新变异的重要机制，也可能导致该物种进化。Benharrat等[15]利用rbcL（叶绿体1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基编码基因rubisco large subunit）质体基因进行核苷酸序列分析，并结合形态学特征对采自法国西部的120多份列当属样品进行鉴定，提出了将分子鉴定和形态特征分析相结合来确定物种的新方法，并讨论了rbcL在分类学中的应用价值。Kirilova等[16]基于核糖体ITS （internal transcribed spacer，核糖体内部转录间隔区）序列的种属区分方法，对从保加利亚不同地区土壤样品中分离的Phelipanche ramosa L.、P.mutelii、O.cumana种子进行分类鉴定，研究3个物种的种群结构和种内变异，结果表明O.cumana种群目前是稳定的，P.mutelii种群正处于活跃扩张时期，而P.ramosa种群正在收缩。虽然国内外已有列当种群分类鉴定的相关报道[1213]，但形态学上有差异的弯管列当种群分化和进化关系以及种群内的遗传结构、遗传多样性尚不明确。近年来，随着分子技术的飞速发展，DNA 条形码技术（DNA barcoding）在生物多样性评估和物种鉴定中的应用越来越广泛[1720]。DNA 条形码（DNA barcode）是利用生物体内一段标准的、高度保守的、易扩增且相对较短的DNA 片段对物种进行快速分类的技术，是对传统形态学方法的有效补充[21]。利用DNA条形码技术结合传统分类学方法，可从形态、分子水平对不同弯管列当种群进行分类鉴定及遗传多样性分析。

目前，国内针对弯管列当的研究主要集中在寄生机理、生物学特性、生理小种鉴定、危害和防除等方面，有关弯管列当群体内遗传多样性的研究鲜见报道，尚无人采用DNA条形码技术结合传统分类学方法对弯管列当种群进行分类鉴定及遗传多样性分析。本研究利用rbcL、matK（tRNA成熟酶编码基因maturase K）、ITS2保守区段的序列特征和变异特点对采自我国向日葵主产区的58份弯管列当样品进行遗传进化差异分析，同时结合弯管列当种子扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）形态差异分析结果，探讨不同弯管列当种群的遗传结构和亲缘关系，分析我国弯管列当种群的遗传进化程度，以期为防治弯管列当和向日葵抗性育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料弯管列当于2017年-2019年每年8月、9月从北京、河北、吉林、内蒙古和新疆向日葵田采集，共计58份样品。其中，北京延庆样品1份（BJ1）;河北省涿鹿县、蔚县样品3份（HB1，HB2，HB3）;吉林省农安县、长岭县、大安市、通榆县、洮南区样品14份（JL1，JL2，JL3，JL4，JL5，JL6，JL7，JL8，JL9，JL10，JL11，JL12，JL13，JL14）;内蒙古开鲁县、武川县、四子王旗、察哈尔右旗、达茂旗、乌拉特前旗、五原县、临河区样品20份（NM1，NM2，NM3，NM4，NM5，NM6，NM7，NM8，NM9，NM10，NM11，NM12，NM13，NM14，NM15，NM16，NM17，NM18，NM19，NM20）;新疆新源县、巩留县、北屯市、布尔津县、哈巴河县、吉木乃县样品20份（XJ1，XJ2，XJ3，XJ4，XJ5，XJ6，XJ7，XJ8，XJ9，XJ10，XJ11，XJ12，XJ13，XJ14，XJ15，XJ16，XJ17，XJ18，XJ19，XJ20）。采集的彎管列当植株和种子样品，带回实验室后于-20℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取及检测

称取弯管列当顶端幼嫩组织或苞片30 mg于2 mL离心管中，同时加入2粒直径3 mm的无菌钢珠，装入适配器后液氮冷冻2 min，使用TissueLyser Ⅱ样品破碎仪（北京天根生化科技有限公司）30 Hz破碎45 s，将样品破碎至粉状，利用新型植物基因组DNA提取试剂盒（DP320-03，天根生化科技有限公司）提取基因组DNA。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测样品DNA的完整性，使用NanoDrop One超痕量UV分光光度计（基因有限公司）检测DNA的浓度和纯度，并将DNA稀释至工作浓度30 ng/μL，置于-20℃冰箱保存。

1.2.2 PCR扩增及测序

参考国际DNA条形码通用引物[2224]进行PCR扩增、测序及分析（表1）。PCR反应采用30 μL体系，包括DNA模板1 μL、上、下游引物各1 μL、2×TSINGKE Master Mix 15 μL、ddH2O 12 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，最适退火温度退火30 s，72℃延伸相应时间，共35个循环;72℃延伸10 min。置于T100TM PCR扩增仪（Bio-Rad公司）完成扩增后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。最后利用Tanon-3500凝胶图像分析系统（北京原平皓生物技术有限公司）观察，选取条带清晰、单一的PCR产物送至北京擎科新业生物技术有限公司进行双向测序。

1.2.3 数据分析

应用Vector NTI软件对各个样品测序峰图进行质量分析，通过逐一检查、校对碱基去除低质量的序列区并将正反序列拼接。利用MEGA 6.0软件对拼接后的序列进行多重序列比对，计算样品间的遗传距离以获取DNA条形码序列变异信息[25]。利用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统进化树，分析各样品间的亲缘关系，各个分支的bootstrap置信值以1 000次重复来检验。

以“ITS2”、“Orobanche”为关键词在NCBI数据库（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索并下载国内外相关序列37条，利用MEGA 6.0软件将本研究中3种代表型ITS2序列与国内外相关序列进行同源序列比对，构建NJ系统进化树，分析本研究弯管列当种群与国内外弯管列当的亲缘关系。

1.3 种子外观形态观察

1.3.1 种子形态测定

利用100目、120目筛选出成熟饱满的种子，依次用2%次氯酸钠和75%乙醇超声清洗2 min后用无菌水冲洗3遍以上至无色，放置2 d脱水干燥。在超景深三维显微镜（KEYENCE，日本）下观察各种群种子形态，每个种群测量30粒种子的长、宽值。利用R语言3.5.2中的两独立样本t测验来比较不同类型间种子的长度、宽度、大小（长×宽）、形状（长/宽）的差别。

1.3.2 种子的扫描电镜观察

将上述消毒处理后完全干燥的种子作为SEM观察材料。将待观察的种子粘在涂有导电碳素标签的铝存根上，用双面胶固定在样品台上，涂覆金钯后在日立SU-8010型扫描电镜下观察种子显微形态特征并拍照。

参考文献中的专业术语[12， 26]，对不同弯管列当种子进行形态特征描述。

2 结果与分析

2.1 序列特征

将58份弯管列当样品的rbcL、matK、ITS2片段测序结果进行剪切比对，结果表明不同DNA条形码片段在序列长度、PCR扩增及测序成功率、核苷酸差异位点数上均有明显差异（表2）。由于参试样品的rbcL、matK片段无核苷酸差异，种内遗传距离均为0，且matK序列片段的PCR扩增成功率太低（17%），因此不适用于后续分析。58份弯管列当的ITS2片段存在3个核苷酸差异位点，种内遗传距离为0.002～0.007，通过ITS2序列能将不同弯管列当种群区分开，后续将对ITS2片段的差异位点、遗传多样性等进行分析。

2.2 基于ITS2序列的遗传聚类分析

使用Vector NTI和MEGA 6.0软件分析各样品的ITS2序列，采用邻接法构建系统发育树，结果显示58份弯管列当样品聚为3类（图1）。其中，采自北京（BJ1）、河北（HB1、HB2、HB3）与吉林（JL4、JL6、JL8）的7份样品亲缘关系较近，聚为一类，定为Ⅰ型;采自新疆、内蒙古与吉林的样品中有50份样品聚为一类，定为Ⅱ型;采自内蒙古开鲁县的NM1介于两者之间，定为Ⅲ型。

2.3 基于ITS2序列的差异位点、遗传距离分析

58份弯管列当样品的ITS2序列存在3个差异位点，分别是106位C/T、175位C/T、及273位G/T差异。在106位和175位Ⅰ型和Ⅲ型碱基为C，Ⅱ型碱基为T;在273位Ⅰ型碱基为G，Ⅱ型和Ⅲ型碱基为T（图2）。由于同一类型碱基序列相同，故选用3个类型计算遗传距离，结果表明Ⅰ型与Ⅱ型亲缘关系最远，遗传距离为0.006 7，Ⅰ型与Ⅲ型亲缘关系最近，遗传距离为0.002 2，Ⅱ型与Ⅲ型遗传距离为0.004 4。

2.4 弯管列当系统进化树分析

将3种类型弯管列当的ITS2序列测序结果与NCBI数据库中相关序列进行比对，聚类结果表明采集到的58份样品均为弯管列当。其中，Ⅰ型、Ⅲ型与中国、美国、西班牙、格鲁吉亚、澳大利亚报道的O.cernua（NCBI登录号AY911235.1、EU655624.1、AY960726.1、AY209230.1、AY209231.1、AY209232.1、AY209233.1）亲缘关系较近聚为一类;Ⅱ型与以色列、中国报道的O.cernua var. cumana、O.cernua （NCBI登录号EU655627.1、KC811238.1）亲缘关系最近聚为一类（图3）。

2.5 形态学鉴定结果

田间采样过程中发现Ⅰ、Ⅱ型植株形态存在显著差异，其中Ⅰ型花序密集，有50～80朵花;Ⅱ型植株花序疏松，有20～50朵花。由于个别样品采集到的是植株并未采集到種子，因此采取抽样法从Ⅰ型的7份材料中抽取4份，Ⅱ型的50份材料中抽取15份，Ⅲ型1份，共计20份材料进行种子形态鉴定。在显微镜下对其形态进行观察和测量，结果表明（图4），3种类型弯管列当种子在长、宽、大小、形态上均存在差异。Ⅰ型弯管列当种子长267～457 μm，宽121～218 μm，多为卵圆形，Ⅱ型种子长260～578 μm，宽104～360 μm，多为长椭圆形，Ⅲ型种子长236～419 μm，宽141～212 μm，多为倒卵形。种子大小（长×宽）依次为Ⅱ型>Ⅲ型>Ⅰ型，其中，Ⅰ型种子大小显著小于Ⅱ型（P<0.001），Ⅱ型种子显著大于Ⅲ型（P<0.001），Ⅰ、Ⅲ型种子大小差异不显著（P>0.05）。种子长/宽依次为Ⅱ型>Ⅰ型>Ⅲ型，其中Ⅰ、Ⅱ型种子长/宽显著大于Ⅲ型（P<0.001），Ⅰ型种子长/宽显著小于Ⅱ型（P<0.001），表明Ⅱ型弯管列当种子最为瘦长。

扫描电镜结果表明（图5），3种类型弯管列当种子的表面均呈网状纹饰，但网纹形状、网脊粗细、网眼凹陷程度均有细微差异。其中，Ⅰ型弯管列当种子多为卵圆形，种脐收缩褶皱，但种脐端较平，网脊深，种皮有脊状突起的卵圆形网状纹饰，网纹里有形状规则的蜂巢状凹点小网眼;而Ⅱ型弯管列当种子多为长椭圆形，明显比Ⅰ、Ⅲ型种子细长，种脐明显收缩褶皱呈锥形，网脊光滑、突起明显，脊之间凹陷形成纵矩形大网状纹饰，网纹里有分布密集的蜂巢状凹点小网眼，与Ⅰ型相比网眼凹陷较深。Ⅲ型弯管列当种子多为倒卵形，与Ⅰ型较为相似，种脐收缩褶皱，方形网状纹饰网纹里有形状规则的小网眼。

3 讨论

3.1 基于ITS2序列和种子形态学鉴定的弯管列当遗传多样性分析

DNA条形码技术具有操作简单、准确度高、不受环境和物种等因素限制、方法通用性强等优势，是分析群体遗传多样性的常用技术之一[21]。Ahmed等[23]利用rbcL、matK条形码对巴基斯坦俾路支省不同地区采集的15个列当属样品进行遗传分化鉴定，发现matK在列当物种鉴定中的表现优于rbcL，也可作为其他植物物种鉴定的候选基因。Schneeweiss等[24]采用ITS条形码对全寄生列当科的系统发育和种内变异进行遗传多样性分析，结果表明列当科分为两个谱系，ITS的种内变异低与种内形态变异性、寄主范围均无关。本试验利用DNA条形码技术对中国向日葵主产区采集的58份弯管列当进行rbcL、matK、ITS2片段扩增和比对分析，发现仅ITS2条形码适用于弯管列当种群遗传多样性分析。基于ITS2条形码聚类结果表明我国不同弯管列当种群也不是单系的，聚为3类，与上述研究结果一致。在本试验中，matK基因扩增及测序成功率较低（17%），可能与该基因扩增时通用引物有效性较差有关。虽然rbcL在扩增和测序成功率上能达到100%，但该基因序列在弯管列当中保守性高，进化速率较慢，种内差异极小，不适合作为DNA条形码序列对弯管列当进行种群遗传分化研究。

目前，弯管列当和向日葵列当O.cumana的命名较混乱，两个名字在文献中都有记载。石必显等[27]利用ISSR标记对我国不同省区的向日葵列当进行遗传聚类，结果表明可被聚成两个亚组，其中河北、山西和陕西种群聚成一个亚组，吉林、内蒙古和新疆种群聚成另外一个亚组。本研究中ITS2条形码聚类结果与石必显等研究结果有相同之处，我国不同弯管列当种群大致按照地理分布聚为3类。总体上来自相邻地区的样品聚类在一起，地理分布越近，亲缘关系往往越近，但也存在个别差异，比如采自吉林省同一田间的样品（JL4、JL6、JL8和JL5、JL7、JL9）呈现复杂类群聚为2类（Ⅰ型、Ⅱ型）。内蒙古地区和新疆地区是我国主要向日葵种植区[3]，以食葵种植为主，种子多采用抗性品种及国内外杂交引种，在向日葵栽培历史悠久、播种面积大、种源复杂的情况下寄主已经对弯管列当做出了选择，因而弯管列当种类很单一，聚为一类。而吉林地区列当种群聚为2类可能是由于近年来弯管列当危害严重[28]，向日葵种植面积大幅下降，主要以种植当地的传统品种为主，因此可能筛选出等级较低的列当生理小種，从而呈现复杂类群;也可能是当地种子调运时携带列当种子、列当种内存在基因交流以及寄主（向日葵栽培品种）不同，列当出现不同等级进化有关。

本研究所采集的弯管列当植株形态存在明显差异，其中Ⅰ型植株花序密集，有50～80朵花，花冠蓝色或紫色，而Ⅱ型植株穗状花序松散，有20～50朵花，花冠白色或淡蓝色，与Pujadas-Salvà等[13]对列当属的形态分类研究结果一致。种子扫描电镜结果表明3种类型弯管列当在种子大小、形状、种脐、种皮网纹、网眼等微观形态结构方面存在细微差别，与王定国等[12]的研究结果一致。不同弯管列当种群在植株形态、种子微观形态存在差异可能与不同环境条件下表型的变异、生理小种的进化有关。

近年来，随着我国向日葵大面积种植、引种混乱、检疫滞后、人类活动等因素影响，大部分向日葵种植区受到根部全寄生杂草弯管列当的严重威胁[34]。我国不同向日葵种植区弯管列当的遗传多样性可以归因于基因交流和地理生态环境等。此外，不同的寄主栽培品种、气候环境、土壤条件、人为活动等都可能影响弯管列当种群的表型及遗传结构变异。

3.2 3种类型弯管列当与国内外弯管列当的亲缘关系

弯管列当随着向日葵的广泛种植逐渐在世界各地蔓延。调查表明，本研究Ⅰ型弯管列当（北京、河北、吉林JL4、JL6、JL8）只在我国小面积向日葵种植区发生;Ⅱ型弯管列当（新疆、内蒙古、吉林部分地区）分布区是我国向日葵的主产区，同时也是弯管列当危害最严重的地区;Ⅲ型（内蒙古开鲁县NM1）介于Ⅰ型、Ⅱ型之间，可能是二者基因交流的结果。基于NCBI数据库中的ITS2序列构建的系统进化树表明，我国Ⅰ型、Ⅲ型弯管列当与世界大部分地区（美国、西班牙、格鲁吉亚、澳大利亚）报道的弯管列当ITS2序列亲缘关系最近，聚为一类，Ⅱ型与以色列报道的弯管列当ITS2序列聚为一类。以上结果表明我国不同地区弯管列当种群遗传背景复杂，主要原因可能与向日葵引种、弯管列当种子传播及种群之间的基因交流有关。此外，由于寄生植物较独特，存在寄主特异性，它们的种群结构也受到寄主的影响，因此其遗传变异可能因寄主种类不同而产生分化。

4 结论

本研究结合微观形态学特征分析，采用ITS2条形码技术，研究了中国主要向日葵种植区寄生杂草弯管列当种群的遗传多样性，发现不同地区弯管列当因生境、寄主（向日葵栽培品种）和遗传背景不同，形成植株形态和遗传组成存在显著差异的3个类群。基于ITS2 条形码和种子形态学观察相结合的方法可用于弯管列当种群遗传多样性研究。本研究为弯管列当防治提供了重要基因资源，为相关向日葵抗性育种奠定了理论基础。

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（责任编辑：杨明丽）