N-甲基-D-天冬氨酸受体在脑创伤介导急性肺损伤过程中的作用

周松，楼颖颖，钱梅姿

颅脑创伤（TBI）可导致全身多系统损害和功能紊乱[1]，其中脑创伤介导的急性肺损伤（TBI-ALI）是其常见的并发症，致病率达20%～25%[2]。同时肺损伤也是TBI继发死亡的主要原因之一，这类患者的致残率和病死率是未合并TBI-ALI的1.5～2倍，严重影响着TBI患者的转归[3]。N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）是神经系统中的一种兴奋性谷氨酸受体，当兴奋性氨基酸谷氨酸增多时，可激活NMDAR介导Ca2+内流，通过引起Ca2+超载而激活细胞内一系列机制介导细胞死亡，参与多种神经系统疾病的发生、发展过程[4]。近年研究发现，NMDAR亦可通过扩大炎性反应的进展加剧肺损伤过程[5]。本研究将通过激活和抑制NMDAR，探究其在TBI-ALI模型中的作用机制。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 清洁级C57BL/6小鼠40只，体质量21～22 g，8周龄，购买于上海实验动物中心。术前12 h禁食，自由饮水。本研究获温州医科大学实验动物伦理委员会审核批准（wydw 2020-0537）。

1.2 方法

1.2.1 分组 随机将小鼠分为4组（n=10）：正常对照组（Sham组）、脑损伤组（TBI组）、TBI+谷氨酸注射组（TBI+Glu组）及TBI+MK-801组（TBI+MK-801组）。

1.2.2 模型制备 采用控制性皮层冲击法制备TBI模型[6]。首先通过1.5%戊巴比妥钠（0.1ml）进行麻醉，选择小鼠前囟和“人”字缝之间左侧颅骨的位置，剪开皮肤约1 cm暴露颅骨，打开骨膜，稳定小鼠头部后持钻进行左侧颅骨钻孔。当有明显落空感时停止钻孔，随后将小鼠置于脑立体定位仪上固定，选定打击参数为深度2mm，时间100 ms，速度3.5 m/s。打击后立即将小鼠取下并置于保温毯上恢复。密切观察记录小鼠生命体征，待呼吸平稳后方可缝合伤口并放回笼内饲养。Sham组除不打击外，其余操作与TBI组相同。谷氨酸（Solarbio G0010 1mg/kg）及MK-801（MedChemExpress HY-15084 0.1 mg/kg）分别于造模后半小时和造模前半小时腹腔内注射。Sham组和TBI组腹腔内注射等量0.9%氯化钠注射液。

1.2.3 标本处理 小鼠造模后24 h取小鼠右肺上叶做干湿比，右肺下叶用4%多聚甲醛固定后制作病理切片，小鼠左肺组织用于免疫蛋白检测。取小鼠肺泡灌洗液用于炎症因子检测。

1.2.4 肺组织HE染色 取小鼠右下肺组织，4%多聚甲醛固定24 h后制备成石蜡切片后行HE染色。在×200放大倍数下，随机取3个视野进行观察，评分由2名实验员通过双盲的方法进行评估。评分细则由4个相对独立的方面：肺泡腔充血、血管出血、炎性细胞浸润情况及肺泡壁厚度。0分：代表正常肺组织；1分：代表轻微损伤，损伤程度＜25%；2分：代表中度损伤，损伤程度25%～50%；3分：代表重度损伤，损伤程度50%以上至75%；4分：代表极重度损伤，损伤程度＞75%。通过累加各指标得分为TBIALI总得分，取3个视野的平均值。

1.2.5 肺组织干湿比测定 采用眼科剪剪取右肺上叶一小块新鲜肺组织，将其置于体重秤进行湿重称量。将组织置于65℃烤箱中烘干，等待24 h，肺组织重量不再改变时记录此时干重。肺组织干湿比重采用湿重/干重来表示，反应肺部水肿情况。

1.2.6 肺泡灌洗液处理 麻醉下仰卧位固定小鼠，采用眼科剪及蚊式直钳小心游离气管周围组织后充分暴露小鼠气管。用5ml注射器针头去尖头后在甲状软骨上方进行气管插管，并用缝线将其固定。1ml注射器每次灌注1ml无菌PBS并重复3次，确保回吸率达到90%以上。将收集到的肺泡灌洗液进行离心1 000 r/min，5 min；其余上清液－80℃保存。用ELISA法测支气管肺泡灌洗液上清中肿瘤坏死因子（TNF-）、白介素-1（IL-1）及白介素-10（IL-10）炎症指标。ELISA试剂盒TNF-、IL-1及IL-10均购自美国Ebioscience。

1.2.7 肺组织相关蛋白测定 提取左肺组织蛋白，置－80℃保存。BCA法测定蛋白浓度，取总量50g蛋白进行上样，行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳，电泳后转至PVDF膜，封闭。随后条带置于TBST液中清洗3次，转移至一抗抗体孵育盒中，4℃摇床孵育至少8 h以上。一抗浓度：转录因子p-NFAT（美国Invitrogen PA5-38301 1∶1 000）、血管内皮细胞间黏附分子（ICAM-1，美国Abcam AB179707 1∶1 000）及ACTIN（美 国Abcam AB8227 1∶2 000）。一抗孵育结束后，将条带转移至TBST中清洗3次，摇床上缓慢摇动，10 min/次。常温孵育二抗2h后采用ECL法进行曝光。曝光后的条带采用Image J软件进行分析。

1.3 统计分析 数据采用SPSS23.0软件统计分析，计量数据以均数±标准差表示，多组间比较采用F检验，多重比较采用Turkey检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对肺损伤病理组织学的影响 Sham组呈现了正常的肺组织表现；小鼠TBI造模后，肺组织出现了典型的炎症病理反应，表现为中性粒细胞浸润聚集，肺泡壁增厚，肺泡腔出血及肺组织间隙水肿等。在TBI+Glu组，谷氨酸进一步激活NMDAR后，肺损伤积分较单纯TBI组更高（t=6.72，P＜0.05）。使用NMDAR阻断剂MK-801后，小鼠TBI后的肺损伤明显减轻，与Sham组差异无统计学差异（t=1.34，P＞0.05）。见封二彩图1～2。

2.2 NMDAR的激活对肺组织干湿比影响 TBI小鼠造模后肺组织干湿比较Sham组明显增加（t=6.14，P＜0.05），TBI+Glu组干湿比较TBI组进一步增加（t=2.59，P＜0.05）；使用MK-801的TBI小鼠干湿比较TBI组发生下降，与Sham组差异无统计学意义（t=1.45，P＞0.05）。见封二彩图3。

2.3 肺组织中炎症因子TNF-、IL-1及IL-10的变化 TBI组TNF-、IL-1及IL-10水平均高于Sham组（t≥4.28，均P＜0.05）。TBI+Glu组小鼠TNF-、IL-1及IL-10水平均高于TBI组（t≥2.48，均P＜0.05）。TBI+MK-801组小鼠TNF-、IL-1及IL-10水平与Sham组差异无统计学意义（t≤1.85，均P＞0.05）。见表1。

表1 肺组织中炎症因子TNF-、IL-1及IL-10的变化（=10）pg/ml

2.4 肺组织中p-NFAT及ICAM-1蛋白变化 免疫蛋白学结果显示，TBI组p-NFAT表达较Sham组下降，但ICAM-1表达量增加（t=4.11、4.51，均P＜0.05）。TBI+Glu组小鼠p-NFAT较TBI组下降，ICAM-1表达量却增加（t=7.00、4.81，均P＜0.05）。TBI+MK-801组小鼠2种蛋白表达与Sham组差异均无统计学意义（t≤0.48，均P＞0.05）。见封二彩图4。

3 讨论

本研究结果显示，TBI后小鼠可发生TBI-ALI，表现为造模后小鼠肺组织干湿比、肺泡灌洗液中炎症因子TNF-、IL-1及IL-10表达增加，肺组织病理损伤加重。注射谷氨酸后肺损伤较单纯TBI组加重，而MK-801的使用则减轻了肺损伤的发生。此外，通过蛋白检测肺组织中p-NFAT以及ICAM-1的改变，证明NMDAR加剧肺损伤过程与激活内皮细胞中NFAT信号通路相关。

TBI-ALI发生的机制多种多样，其中爆破理论以及渗透性损伤理论被广泛接受[7]。全身炎症系统反应在TBI-ALI中发挥着重要作用，TBI可通过增加颅内炎症因子的释放入血到达外周器官引起损伤，又可通过促进神经递质的传递到达靶器官，引起靶器官内炎症因子的表达[8]。本实验采用控制性皮层损伤构建小鼠TBI模型，通过检测肺组织干湿比改变，BALF液中炎症因子表达及肺组织HE染色，发现TBI组较Sham组干湿比增加，且炎症因子TNF-、IL-1及IL-10表达也上升。此外，TBI组小鼠肺组织HE染色发现肺泡间隔炎症细胞浸润，出血和水肿较Sham组严重。以上结果表明TBI模型建立，并成功诱导了TBI-ALI的发生，且其与炎症反应的发生密切相关。

NMDAR作为一种谷氨酸离子型受体，不仅存在于神经系统中，在肾、肺、胰岛 细胞以及血管等组织中均有表达[9]。研究发现，血液中谷氨酸水平与TBI-ALI的严重程度密切相关[10]。本研究结果发现，TBI+Glu组肺组织损伤较单纯TBI组发生明显的加重，表现为干湿比的增加，炎症因子TNF-、IL-1及IL-10表达上升，病理组织学评分的增高。而予抑制剂MK-801后，通过阻断NMDAR在肺组中的作用，TBI组小鼠肺组织较单纯TBI组减轻，与Sham组差异无统计学意义（P＞0.05）。进一步阐明了NMDAR在TBI-ALI模型中的兴奋性作用，而阻断NMDAR则可抑制炎症因子的产生，从而对肺损伤起到保护作用。

转录因子NFAT首次在激活的T细胞中被发现，以磷酸化的形式存在于静息状态下，而当钙调蛋白磷酸酯酶Calcineurin和NFAT激酶结合时，NFAT的磷酸化状态改变并被激活，随即入核促进下游炎症基因的表达[11]。NFAT介导的炎症信号通路与肺损伤有着密切联系，NMDAR是NFAT的重要上游调节机制，两者通过Ca2+信号传递枢纽，共同参与神经细胞的活性调节[12]。基于以上研究结果，本实验对NFAT在TBI-ALI发生过程中的作用进行探究。结果显示，TBI组及TBI+Glu组p-NFAT较Sham组发生了下降，其中以TBI+Glu组下降更明显，提示NFAT转录因子在TBI组以及TBI+Glu组中被激活。ICAM-1在TBI组及TBI+Glu组表达较Sham组增加，其中TBI+Glu组增加更多。可见内皮细胞损伤较Sham组严重。在TBI+MK-801组，两种蛋白与Sham组表达差异均无统计学意义（均P＞0.05），表明炎症反应在使用NMDAR抑制剂MK-801后被抑制且内皮细胞得到了保护。进一步证明NMDAR的激活加剧了TBI-ALI的发生，且此过程可能与内皮细胞中NFAT被激活产生炎症因子相关。

综上所述，本研究发现了TBI-ALI损伤过程中的新机制，即NMDAR可激活内皮细胞中NFAT，使其促进大量炎症因子的表达从而介导肺损伤的发生。因此，有效阻断NMDAR在TBI-ALI产生过程中的作用，可减少炎症因子的产生，尽早避免肺损伤的发生。