碳硫双手性邻苯二甲酰类鱼尼丁受体杀虫剂研究进展

李林珊，谢伟彬，郑占英，李正名，周 莎

(南开大学 元素有机化学研究所 农药国家工程研究中心，天津 300110)

近年一些具有传统作用机制的杀虫剂品种(如有机氯、有机磷等)因毒性、残留等问题被禁用，而氟虫腈(fipronil)、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪等杀虫剂因蜂毒或对水生动物不良影响被欧盟限制使用，因此全球对安全、环境友好杀虫剂的需求愈来愈迫切。创制对人畜和非靶生物体影响较小，具有超高生物活性、高选择性的绿色杀虫剂是杀虫剂可持续发展的迫切需求。鱼尼丁受体类杀虫剂是继新烟碱类杀虫剂后受市场欢迎的一类杀虫产品，其结构新颖、作用机制独特、高效广谱。本文介绍了碳硫双手性邻苯二甲酰类鱼尼丁受体杀虫剂及其结构活性研究进展，为该类杀虫剂创制研究提供指导。

1 鱼尼丁受体类杀虫剂

1.1 作用机制

鱼尼丁受体类杀虫剂作用于昆虫体内非电压门控钙离子释放通道，能有效调控昆虫体内钙离子流量，引起昆虫肌肉调节功能失效，导致昆虫不自主地抽搐、瘫痪和死亡，从而表现出优异的生物性能[1]。这类杀虫剂具有对环境友好、广谱、高效等优势。

1.2 结构模型

鱼尼丁受体主要存在于神经细胞的内质网(endoplasmic reticulum，ER)膜、肌肉细胞的肌质网(sarcoplasmic reticulum，SR)膜上，是由4个相同亚基组成的一类钙离子释放通道(calcium release channel，CRC)。图1展示了其中的2个亚基，每个亚基大约由5 000个氨基酸组成，分子量约为565 kDa，鱼尼丁与鱼尼丁受体结合的位点位于通道孔道内侧。

图1 鱼尼丁受体结构示意图[2]

随着计算机三维重组技术与冷冻电子显微镜的快速发展，已得到了鱼尼丁受体的结构模型，图2为不同角度的鱼尼丁受体三维结构的图像[3]。从侧面的角度，鱼尼丁受体的结构整体上类似于蘑菇状，胞浆区(cytoplasmic domains)是较大的伞部部分，该结构将鱼尼丁受体与细胞膜紧密联系起来；RyR的跨膜区(transmembrane domains)是较小的柄部部分，位于C末端，孔径约1～2 nm，形成钙离子释放通道，跨膜区大约包含 4～12个跨膜片段(transmembrane segments)。跨膜区一方面是释放Ca2+的通道，另一方面能将鱼尼丁受体固定于肌浆网(sarcoplasmic reticulum，SR)上。从顶部和底部角度来看，较大的胞浆区和较小的跨膜区均呈正方形。

图2 鱼尼丁受体的三维结构图像——四聚体“蘑菇状”[3]

1.3 商品化的鱼尼丁类杀虫剂

人们对于昆虫独特的作用靶标——鱼尼丁受体进行探索，最初研究的主要着眼点在于鱼尼丁的结构修饰。第一类作用于鱼尼丁受体的植物源农药是鱼尼丁碱(ryanodine)，其结构(图3)复杂难以合成[4]，天然鱼尼丁碱于20世纪60年代退出杀虫剂市场。兰尼醇(ryanodol)是通过鱼尼丁结构修饰方法得到的唯一公认的商品化化合物[5]。通过多年的探索研究，商品化鱼尼丁受体杀虫剂有日本农药公司创制成功的氟苯虫酰胺(图4，flubendiamide)[6]，它是世界上第一个鱼尼丁抑制剂。在此基础上杜邦公司开发出药效更优的氯虫苯甲酰胺和溴氰虫酰胺[7]。此外，随后陆续上市的商业化品种有四氯虫酰胺、环溴虫酰胺、四唑虫酰胺和溴虫氟苯双酰胺。这类化合物对人体没有不良影响，专门调节昆虫体内钙离子通道[8]。因此，该类超高效杀虫剂上市后迅速垄断了国内外市场，代表了创制生态环保型杀虫剂的新方向。杜邦借此发明已3次获得国际植保科技界颁发的“最佳研发奖”。

图3 天然鱼尼丁碱的结构式

图4 氟苯虫酰胺、氯虫苯甲酰胺和溴氰虫酰胺

2 含碳硫双手性鱼尼丁受体杀虫剂研究进展

当今世界上使用的农药中25%以上具有手性的特点[9]。这类手性农药，一般含有碳、磷或氮原子等。目前，已商品化的650余种农药中，手性农药占全球农药市场的35%，且其比例仍在上升之中。由于生物体对各手性异构体识别能力的差异，以及不同靶标对不同手性异构体的匹配性关系，因此各手性体之间往往呈现出不同的生物活性[10]。单一高活性手性体或不含无效手性体的手性农药以低的剂量表现超高的药效，减少农药使用量，提高了效益。因此，近年对手性农药的研究成为热点。

氟苯虫酰胺在 1998年发现，2007年上市。据报道，氟苯虫酰胺在 2018年全球销售额就已达到4.77亿美元[11]，2013-2018年的复合年增长率是15.3%。国际上对这种具有新颖作用机制的鱼尼丁受体杀虫剂的手性化学研究报道甚少，创制具有更高生物活性的手性双酰胺类杀虫剂和总结其构效关系有待深入探索。

2012年本课题组报道一类硫亚胺和亚磺酰亚胺结构的化合物，研究结果表明此类结构物表现优异的杀东方黏虫和小菜蛾活性[12,13]，个别化合物对小菜蛾的生物活性高于商品化对照药剂氟苯虫酰胺，其LC50略低于氟苯虫酰胺(图5，表1和表2)。

表2 化合物a、b和氟苯虫酰胺对小菜蛾的半致死浓度对比

图5 高活性化合物a和b的结构式

表1 化合物a、b和氟苯虫酰胺对小菜蛾幼虫的活性对比

优异的生物活性启发我们进一步深入探索，保留1个碳手性中心，首次引入第2个手性中心开展了手性硫亚胺和亚磺酰亚胺类的工作，设计合成了未见报道的含碳硫双手性的邻苯二甲酰胺类化合物(图6)，进一步研究手性化合物对东方黏虫和小菜蛾的生物活性。

图6 硫亚胺和亚磺酰亚胺类化合物的结构设计

结构中有2个手性中心，因此试验中得到4个光学体[14,15]，这也是首次报道含有光学活性的硫亚胺和亚磺酰亚胺类结构的邻苯二甲酰胺类化合物(图7)。

图7 N-CN硫亚胺类化合物结构以及对东方黏虫的生物活性

根据以上数据可以得到N-CN的硫亚胺类化合物不同异构体对东方黏虫的活性是(Sc, Ss)≥(Sc,Rs)＞＞(Rc, Ss)＞(Rc, Rs)[14]；而N-COCF3的硫亚胺类化合物对东方黏虫的活性规律顺序是(Sc, Rs)≥(Sc,Ss)＞＞(Rc, Ss)＞(Rc, Rs)[15]。由此可以推测手性碳和硫共同的协调效应可能致使不同的异构体呈现不同的生物活性。苯环部分化合物的活性最高的为碘取代的化合物，化合物C和D的LC50分别为0.050 4、0.069 9 mg/L，均低于氟苯虫酰胺(0.123 0 mg/L)。值得一提的是部分化合物对小菜蛾的生物活性远远高于对照药剂氟苯虫酰胺2个数量级(图8和表3)，化合物E和F对小菜蛾的生物活性分别是100% (10-6mg/L)和80% (10-6mg/L)，氟苯虫酰胺的杀虫活性是0%(10-4mg/L)。大部分N-COCF3结构物的生物活性优于相应的N-CN结构物的生物活性，可能是N-COCF3的结构具有较好的亲脂性和疏水性。CoMFA分析结果表明N-COCF3的体积效应致使N-COCF3结构化合物的活性高于相应的N-CN结构的化合物[16-18]。笔者与中国农科院植保所合作展开对化合物 C进行转录测序的相关试验，测试结果表明：目标化合物 C可能作用于调控钙离子释放通道的鱼尼丁受体，导致肌质网钙泵中的钙离子释放，当钙离子进入胞浆，致使胞浆中钙离子浓度升高激发了相关的肌肉收缩反应，从而使与其相关的肌球蛋白、肌动蛋白、肌联蛋白、unc-89以及抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因表达量上调[19-21]。

图8 化合物E和F的结构式

表3 化合物E、F和氟苯虫酰胺对小菜蛾幼虫的活性对比

这也是首次将手性硫引入RyR杀虫剂中，初步地探索手性硫和碳存在协同效应对生物活性的影响。

基于前期对硫亚胺类和亚磺酰亚胺类化合物生物活性的研究[22,23]，单甲基手性硫亚胺类和亚磺酰亚胺类结构化合物的生物活性优于相对应的2个甲基的双酰胺类衍生物。因此笔者初步得出结论，从分子的设计角度来讲，脂肪酰胺链中第2个甲基在含有硫亚胺和亚磺酰亚胺结构的邻苯双酰胺类结构中可能不是生物活性的必要条件，随后对此类结构进一步拓展，深入研究其构效关系。

Casida宣称现在是RyR和GABA-R (γ-aminobutyric acid receptor，γ-氨基丁酸受体)的黄金时代[24]。鱼尼丁受体杀虫剂所具有高效低毒、结构新颖、作用机制独特、对环境友好、对哺乳动物安全等优点，目前是杀虫剂领域的研究重点和热点。绿色生态农药鱼尼丁受体杀虫剂，以及作用于GABA-R独特的作用位点的异噁唑啉化合物(isoxazolines)和间甲酰胺基苯甲酰胺类化合物具有安全高选择性的特点[25]，更加激发我们对绿色生态杀虫剂的不断探索。

3 总结与展望

截至目前，天津大学的尉迟之光教授解析了昆虫鱼尼丁受体的磷酸化功能域的高分辨晶体结构，揭示了昆虫与哺乳动物的显著区别[26]。另外该研究团队通过计算机建模和分子对接的方法研究发现小菜蛾钙离子通道鱼尼丁受体开关调节机理，与杀虫剂的识别结合机制，以及小菜蛾产生抗药性的分子机理[27,28]。这对解决杀虫剂的抗药性，及绿色农药研发意义重大。但是双酰胺类杀虫剂真正的作用机制还有待进一步明确，杀虫剂与昆虫鱼尼丁受体杀虫剂的结合位点和结合机制也有待进一步探讨，也未得到杀虫剂分子与鱼尼丁受体对接的单晶结构，因此还有很长的路要走。

新农药创制不仅要求所创制产品高效，且对温血动物低毒、对环境无不良影响。碳硫双手性邻苯二甲酰类鱼尼丁受体杀虫剂研究进展为创制具有我国自主知识产权的新型鱼尼丁受体杀虫剂提供了一定的理论基础，对新农药创制工作具有指导意义。