萝卜对土壤中全氟辛酸赋存形态影响及吸收特征

吕雪艳，李政宇，杜文超，郭红岩，于志国，吴吉春，孙媛媛*

（1.南京信息工程大学水文与水资源工程学院，南京 210044；2.南京大学环境规划设计研究院集团股份公司，南京 210000；3.南京师范大学环境学院，南京 210023；4.南京大学环境学院，南京 210023；5.南京大学地球科学与工程学院，南京 210023）

全氟及多氟化合物（Per-and polyfluoroalkyl substances，PFAS）具备疏水疏油、热/化学稳定性和高表面活性等特点，被广泛应用在工业生产和日常生活等多个领域。长达60 a的生产和使用导致大量PFAS进入多种环境介质，如土壤、地下水和沉积物等，成为近年来备受关注的一类新污染物。土壤是PFAS最重要的环境储蓄库之一，施用污泥、农药下渗和大气干湿沉降等是其进入土壤的主要途径，污染场地土壤中PFAS浓度甚至高达mg·kg数量等级。作为持久性有机污染物（POPs），PFAS具有环境持久性、生物累积性和高毒性等特征，土壤PFAS污染对人类健康的潜在风险已成为目前全球关注的热点。

土壤有机污染物可划分为3种赋存形态：可脱附态、有机结合态和残渣态，可脱附态、有机结合态污染物分别具有较高和中等的生物可利用性，而残渣态污染物很难或几乎不能被植物根系吸收，生物可利用性极低。因此，土壤中有机污染物的赋存形态决定其生物可利用性，进而影响其对周围环境和生物的环境风险。已有研究指出，植物根际显著改变土壤中有机污染物的形态分布，改变其生物有效性。部分学者虽然已对土壤PFAS污染的环境风险开展研究，但多数研究仅关注PFAS的植物毒性，发现PFAS可以显著抑制植物生物量、降低净光合速率、改变根和叶的代谢通路。但是，关于植物能否改变土壤-植物系统中PFAS的赋存形态并影响PFAS的生物可利用性还未见报道。而国内外多项研究指出，有机污染物环境风险的精准评估必须基于土壤中有机污染物的生物可利用性而非总浓度。因此，考虑植物对土壤中PFAS生物可利用性的影响，对于准确评估PFAS在土壤-植物系统中的环境风险具有重要意义。

基于此，本研究以土壤中检出频率和浓度较高的全氟辛酸（PFOA）作为代表性PFAS，选择根系较发达的萝卜为代表性植物，探究萝卜对土壤中PFOA赋存形态影响及吸收特征。采用连续提取法分析土壤中PFOA赋存形态，揭示萝卜对土壤中PFOA赋存形态的改变，通过测定萝卜的生物量和光合指标，评估PFOA对萝卜的毒性作用。

1 材料与方法

1.1 PFOA

放射性标记PFOA-[1-14C]（C-PFOA）购自美国放射性化学公司，放射性为2.035 GBq·mmol，放射化学纯度99%。未标记PFOA（CAS 335-67-1，96%分析纯）购自德国克曼公司。

1.2 植物培养

供试土壤采自江苏省南京市六合试验基地（0～20 cm），土壤风干、敲碎、过2 mm筛后密封保存备用。本课题组前期发表文章已对土壤理化性质进行表征，土壤pH为6.43，有机碳含量为10.3 g·kg，总氮、总磷和总钾分别为1.1、0.29 g·kg和9.17 g·kg。

参考实际工业污染土壤PFOA污染水平，将土壤PFOA浓度设为0.2 mg·kg和5 mg·kg（以干质量计）。用50μCiC-PFOA和未标记PFOA储备溶液（10 mg·L）配制PFOA原液，水浴超声混匀。将风干土壤和一定量PFOA原液充分混合并老化10个月，分析老化后土壤放射性C-化合物浓度为0.20 mg·kg和4.67 mg·kg。实验共设置5个处理：包括3个种植萝卜组（土壤中PFOA浓度分别为0、0.2 mg·kg和5 mg·kg，分别记为空白、PFOA 0.2-有种植和PFOA 5-有种植），和2个无种植组（土壤中PFOA浓度分别0.2和5 mg·kg，分别记为PFOA 0.2-无种植和PFOA 5-无种植），每个处理设4个重复。

供试萝卜（L.）品种为扬花萝卜，购自绿领种业有限公司（江苏南京）。将种子播种于上述不同处理组土壤中并温室培养，培养盆尺寸为10.5 cm×15 cm×11.5 cm，培养期间不添加任何肥料。控制温室昼/夜温度为28℃/20℃，相对湿度为60%，光照为200μmol·m·s。土壤湿度保持在60%～70%之间，实验期间无渗滤液产生。

1.3 光合参数

收获前一周测定植物的光合参数。测定萝卜顶部第三片叶片的叶绿素含量，取0.1 g叶片置于研钵内，加入少量石英砂充分研磨变白，无水乙醇冲洗研钵、研棒及残渣至离心管中，摇匀后置于4℃冰箱，避光条件下待乙醇将叶绿素提取完全后，4 000 r·min离心10 min后取上清液，采用分光光度计（Shimadzu，日本）在663 nm和645 nm波长下测定并计算叶绿素a和叶绿素b含量。

通过Li-6800便携式光合仪（Li-COR，美国）测定同一叶片的暗反应参数（/）和气体交换参数，包括净光合速率（Photosynthetic rate，Pn）、气孔导度（Transpiration rate，Gs）、胞间CO浓度（Intercellular COconcentration，Ci）和蒸腾速率（Transpiration rate，Tr）。测定条件为光强200μmol·m·s，气体流动速率700μmol·s，CO浓度400μmol·mol，相对湿度60%。

1.4 生物量和14C放射性活度测定

种子发芽60 d后收获萝卜，依次用自来水和超纯水冲洗植株，每盆植株目数为6株，生长状态无明显差别，将植株分为地上部（茎和叶）和地下部，冷冻干燥至恒质量，称其生物量（地上部+地下部）。收获后的土壤充分混匀后取样并冷冻干燥以备分析。根据C-化合物的放射量计算土壤和植物中PFOA浓度，分别取一定量研磨后植物（分为地上部和地下部）和土壤样品置于生物氧化仪（Sample Oxidizer，Model 307，PerkinElmer，美国）中，高温燃烧生成CO（800～900℃），经碱性闪烁液（xysolve C-400，Zinsser Analytic，德国）吸收后用液体闪烁计数仪（LS6500，Beckman Coulter，Brea，加拿大）测定其C放射量，PFOA回收率为79.0%～82.0%。

1.5 土壤中PFOA赋存形态测定

根据SABATE等和XIANG等的方法，分析土壤中PFOA赋存形态。准确称取1 g冻干土壤于50 mL聚丙烯离心管，加入10 mL含有75 mmol·L2-羟丙基-β-环糊精（HPCD）和0.04 g·mL叠氮化钠（NaN）的提取剂混合物。25℃条件下避光振荡，摇床转速设置为150 r·min，依次在20、60、120、180 h和240 h时取出，3 000 r·min离心20 min后取上清液，将所有上清液混匀，通过LSC测量其放射性，即土壤中可脱附态PFOA，回收率为78.3%～80.3%。将上述提取后土壤风干，准确称取0.5 g干燥土壤于50 mL聚丙烯离心管，加入7.5 mL甲醇并超声10 min，25℃、4 000 r·min条件下离心10 min后取上清液，重复提取3次后，测定所有上清液的放射性，即土壤中有机结合态PFOA，回收率为93.7%～95.2%。土壤中PFOA总量测定同1.4燃烧法，残渣态PFOA为总量与可脱附态、有机结合态PFOA浓度间的差值，即残渣态=总量-可脱附态-有机结合态。

1.6 数据分析

数据结果以平均值±标准偏差表示。采用Excel 2019和SPSS25.0对数据进行计算、统计与处理。通过Duncan多重比较法进行单因素方差分析（显著水平＜0.05）。

2 结果与讨论

2.1 种植萝卜对土壤中PFOA赋存形态的影响

无种植和种植萝卜土壤中PFOA的赋存形态分布如图1所示。低浓度PFOA胁迫下（0.2 mg·kg），种植组土壤中可脱附态、有机结合态和残渣态PFOA的百分含量分别为54.0%、29.3%和16.7%，与无种植组相比（可脱附态：55.5%，有机结合态：17.3%，残渣态：27.2%），有机结合态PFOA增加12个百分点，残渣态PFOA下降10.5个百分点，可脱附态PFOA则无显著变化。可脱附态和有机结合态的有机污染物分别具有较高和中等的生物可利用性，而残渣态生物可利用性极低。因此，种植萝卜可能提高低浓度PFOA污染土壤中PFOA的生物可利用性。前期研究证实植物根系分泌物是影响土壤中有机污染物[包括PFOA、PFOS（Perfluorooctanesulfonate）等]赋存形态的重要因素。因此，种植萝卜使土壤中残渣态PFOA含量下降可能是由于萝卜根系分泌物导致残渣态PFOA发生解吸，相关机制如下：（1）根系分泌物通过竞争PFOA所占据的有效吸附位点或区域，减弱PFOA与土壤间吸附作用，促使PFOA溶解至土壤溶液；（2）根系分泌物，尤其是低分子量有机酸（Low-molecular-weight organic acid，LMWOA），能够溶解土壤中金属离子、Fe/Al氧化物和有机质，提高土壤中多价阳离子、Fe、Al和溶解性有机质的含量。其中，LMWOA能够阻断金属离子桥键的形成，抑制“土壤-多价阳离子-PFOA”三相络合物的形成，并通过对Fe/Al氧化物的溶解作用以降低土壤与PFOA间静电引力，进而促进PFOA发生解吸。另外，疏水作用是控制PFOA吸附行为的重要机制，由于LMWOA促使土壤释放有机质，导致土壤与PFOA间疏水作用减弱，同样有利于PFOA解吸。

高浓度（5 mg·kg）PFOA胁迫下，种植组土壤中可脱附态、有机结合态和残渣态PFOA的百分含量分别为50.3%、27.5%和22.2%，与无种植组相比（可脱附态：55.2%，有机结合态：28.0%，残渣态：16.8%），土壤可脱附态PFOA下降4.9个百分点，有机结合态和残渣态PFOA无显著变化（图1）。与低浓度（0.2 mg·kg）PFOA相比，高浓度PFOA胁迫下种植萝卜对PFOA形态分布影响较小，说明萝卜对PFOA形态分布的影响具有很强的浓度效应。研究表明，有机污染物胁迫浓度能够影响植物根系分泌物的成分组成及含量，如王姣龙等发现高浓度芘使紫玉兰根系分泌物中检测的物质种类减少；万大娟等发现较低浓度多氯代有机污染物（PCOPs）胁迫促进植物可溶性总糖、有机酸和氨基酸的分泌，而较高浓度PCOPs胁迫抑制植物根系分泌可溶性总糖、有机酸和氨基酸。因此，推测不同浓度PFOA胁迫下萝卜根系分泌物可能在数量和成分上存在差异。土壤-植物体系中PFOA形态分布变化可能是土壤性质、PFOA浓度和植物根系耦合作用影响的结果，鉴于土壤性质和根系分泌物种类的复杂性，其中的生化和分子机制还需进一步研究和证明。

图1 不同PFOA浓度土壤中PFOA的形态分布Figure 1 Fraction distribution of PFOA in soil under different concentrations of PFOA exposure

2.2 萝卜对土壤中PFOA的吸收作用

采用放射性示踪剂（即测定C-化合物的放射性活度）检测PFOA在萝卜植株中的吸收和转运特征。萝卜对土壤中PFOA的吸收作用如图2所示，萝卜地上部和地下部均检出C-化合物，0.2 mg·kg和5 mg·kgPFOA胁迫下，地上部C-化合物浓度分别为0.29 mg·kg和26.56 mg·kg，显著高于地下部浓度（0.08 mg·kg和2.29 mg·kg），表明萝卜可从土壤中富集PFOA。0.2 mg·kgPFOA污染土壤中萝卜地下部富集系数（，根放射量/土壤放射量）、地上部富集系数（，茎叶放射量/土壤放射量）和地上部的转运系数（，茎叶放射量/根放射量）分别为0.41、1.45和3.56；5 mg·kgPFOA污染土壤中萝卜的、和分别为0.49、5.69和11.59。由于萝卜地下部同时具有根和茎的特征，缺乏可食用茎和地上茎之间的典型屏障（凯氏带），因此，萝卜地下部的结果更加趋近茎的趋势，而非根的趋势；另外，蒸腾作用是植物吸收、转运PFAS的主要动力，多数PFAS（除大于9的长碳链外）可被植物根系吸收后随蒸腾流转运至地上部发生累积，这可能是萝卜地上部PFOA浓度远高于地下根部的重要原因。与此类似，BLAINE等在探究不同类型植物对土壤中PFAS的吸收转运作用时，发现萝卜地上部PFOA浓度高出地下部5～10倍，其和值分别为0.85±0.17和7.60±1.52。另外，5 mg·kgPFOA胁迫下萝卜地上部和地下部的PFOA浓度（26.56 mg·kg和2.29 mg·kg）均远高于0.2 mg·kgPFOA胁迫下相应萝卜部位的浓度（0.29 mg·kg和0.08 mg·kg），表明高浓度PFOA土壤中萝卜对PFOA的累积作用更强，这与PFAS在生菜、黄瓜和小麦等植物中的累积规律一致，但是目前关于不同剂量PFAS下植物富集能力差异的相关机制尚不清楚。与已有文献对比发现植物对PFOA的富集能力在种属间显著差异，如XIANG等研究了20个品种生菜对PFOA的吸收和转运作用，发现在两种PFOA浓度胁迫下（0.2 mg·kg和1 mg·kg），生菜的和高达17.7±1.54和6.5±0.05；DU等发现黄瓜中PFOA的值高达11.3～17.4。BLAINE等报道了芹菜对PFOA的和值为1.42±0.37和0.71±0.21，西红柿为0.96±0.10和2.42±0.50，豌豆为0.79±0.22和0.52±0.04，ZHANG等发现小麦对PFOA的值较小，仅为0.021。这可能与植物根系生理及比表面积、生长期间的总水分蒸腾有关。

图2 不同PFOA浓度处理土壤栽培萝卜地上部（茎、叶）和地下部中14C-化合物浓度Figure 2 Concentration of 14C-chemical in below（stem and leaf）and above ground of radish plantsgrown in soil treated with different concentrationsof PFOA

2.3 土壤中PFOA对萝卜生长的影响

不同浓度PFOA（0.2 mg·kg和5 mg·kg）胁迫下萝卜生物量（干质量）如图3A所示。与空白组相比，低浓度PFOA胁迫使萝卜生物量显著降低，高浓度PFOA胁迫下无显著差异。实验PFOA浓度范围内，萝卜生长未表现出明显的受害症状，表明萝卜对PFOA污染具有较强的耐受能力。XIANG等研究了多个品种生菜对土壤中PFOA污染的吸收和转运规律，发现PFOA对生菜生物量的影响因生菜品种而异，如部分品种的生物量呈现低浓度PFOA促进而高浓度无显著影响的规律，部分品种的生物量几乎不受PFOA胁迫影响，还有少部分长叶生菜品种的生物量变化与本实验结果相似，即随PFOA浓度的升高呈现先降低后增加的趋势，0.2 mg·kgPFOA胁迫下生菜生物量最小，1 mg·kgPFOA胁迫下生菜生物量与对照组无显著差异，但相应的机制还尚不清楚。PFOA在植物地上部的积累会影响叶片的叶绿素含量和光合作用，进而影响植物生长。本研究通过分析不同实验条件下叶绿素及光合参数的变化发现，与空白组相比，低浓度PFOA胁迫对叶绿素含量（图3B）、净光合速率（图4A）、细胞间CO浓度（图4B）、叶片蒸腾速率（图4C）和气孔导度（图4D）均无显著影响，但显著抑制了暗反应参数（图4E）；高浓度PFOA胁迫对所有测定的光合参数均无显著性影响（图4），这与高浓度胁迫下萝卜生物量与空白组无显著差异一致。具体的微观机制还有待进一步探索和研究。

图3 不同PFOA浓度处理土壤栽培萝卜的生物量及叶片中叶绿素含量Figure 3 Biomass of radish plants and chlorophyll in radish leaves under different concentrations of PFOA exposure

图4 不同PFOA浓度处理土壤栽培的萝卜叶片净光合速率、细胞间CO2浓度、蒸腾速率、气孔导度、暗反应参数Figure 4 Photosynthetic rate，intercellular CO2 concentration，transpiration rate，stomatal conductance，dark reaction in radish leaves exposed to different concentrations of PFOA

在PFOA污染土壤上种植作物或进行植物修复时，需同时考虑植物对PFOA的富集能力及其对PFOA的耐受能力。PFOA污染土壤更适合种植耐受能力强且可食用部分对PFOA富集能力差的作物，本研究中萝卜地下部为可食用部分，对PFOA的富集能力较差（为0.41～0.49），且对PFOA具有一定耐受能力，较适合种植于PFOA污染土壤。

3 结论

（1）低浓度全氟辛酸（PFOA）胁迫下，萝卜使土壤中有机结合态PFOA显著增加、残渣态PFOA显著下降，而高浓度PFOA胁迫下萝卜使土壤中可脱附态PFOA显著降低。

（2）萝卜可从土壤中富集PFOA，且地上部的富集能力远大于地下部，其地下部和地上部富集系数分别为0.41～0.49和1.45～5.69。

（3）低浓度PFOA（0.2 mg·kg）胁迫降低了萝卜生物量，高浓度PFOA（5 mg·kg）胁迫未影响萝卜生物量。