pmTor、CTGF在甲状腺乳头状癌及癌前病变中的表达及其相关性分析①

李 莹，徐 辉，曲灿华，孙玉鸿，赵德明，石怀银

(1.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003;2.佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯 154007;3.解放军总医院第一医学中心病理科,北京 100853)

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)占甲状腺恶性肿瘤的80%以上[1]，在2006～2015年美国癌症发病率稳定且呈下降趋势，但女性甲状腺癌发病率却趋于上升[2]，近几十年来，我国甲状腺乳头状癌的发病率也持续增长[3],极大危害了我国居民的身体健康。一些靶蛋白在PTC的发生和发展中起着及其重要的作用。在众多蛋白分子中，CTGF(结缔组织生长因子)和pmTor对肿瘤细胞的生长、增殖产生一定的生物学效应[4，5]。甲状腺滤泡上皮非典型增生被认为是一种癌前病变，主要表现为甲状腺滤泡细胞呈现一定异型性，核增大，还可见毛玻璃样核，但对于甲状腺滤泡上皮非典型增生性病变的诊断病理形态学上尚无可靠的标准，亦是临床病理诊断中的难点。我们通过免疫组化染色技术拟对CTGF、pmTor蛋白在PTC及滤泡上皮非典型增生性病变中表达情况进行分析，同时分析两者在PTC中表达的相关性，探讨两者与PTC发生、发展之间的关系。为临床寻找滤泡上皮非典型增生恶变倾向提供可参考的新生化指标。

1 材料与方法

1.1 材料

收集解放军总医院(301医院)、佳木斯大学附属第一医院2005～2016年期间甲状腺蜡块组织，随机抽取PTC 患者58例、滤泡上皮非典型增生43例，结节性甲状腺肿38例。PTC组男17例，女41例，年龄7～68岁，平均(43.09±13.49)岁，肿瘤直径0.3～6cm。滤泡上皮非典型增生组患者男9例，女34例，年龄18～78岁，平均(54.94±14.07)岁。纳入标准：(1)病例术前均未经过放化疗或免疫治疗；(2)临床资料及病理标本完整齐备；(3)所有标本均经两位高年资主治医师以上病理医师确诊；(4)PTC组均为甲状腺根治标本；(5)滤泡上皮非典型增生组均为部分甲状腺切除标本；(6)滤泡上皮非典型增生组病例未患有PTC病史。

1.2 主要试剂

即用型兔抗人pmTOR (phospho S2448) 多克隆抗体购自Abcam公司；即用型鼠抗人CTGF(TA806803)单克隆抗体购自Origene公司，EnVisionPlus检测显色系统购自DAKO公司。

1.3 方法

所有组织经10%甲醛固定后脱水、包埋，切片厚度3～4μm，检测pmTor、CTGF蛋白表达。一抗pmTor按1：400稀释，一抗CTGF按1：200稀释，操作按试剂盒说明书进行。EDTA抗原修复液高压蒸汽修复2.5min，3%H2O2避光浸泡10min，以消除内源性过氧化物酶活性。以PBS取代一抗作为阴性对照。结果由两位高年资主治医师以上病理医师采用双盲法进行统计。

1.4 结果判断

高倍镜下(200)观察pmTor和CTGF的阳性表达情况，均以细胞膜、细胞质染色呈棕黄色及深棕色颗粒为阳性表达。以细胞质无色或淡黄色为阴性表达。染色强度判定标准如下：无染色计为0分，微黄色染色计为1分，棕黄色染色计为2分，棕褐色计为3分。根据细胞核和细胞质染色阳性的分数进行分类，癌细胞阳性百分比评定标准：0分=0%癌细胞着色；1分=1%～30%癌细胞着色；2分=31%～70%癌细胞着色；3分=71%～100%癌细胞着色。 最终分数=癌细胞阳性百分比染色强度分数。 0分为阴性表达(-)，1～3分为弱阳性表达(+)，4～6分和9分为阳性和强阳性(分别为++和+++)。

1.5 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析。计数资料采用χ2检验进行分析，采用Spearmon法分析观察pmTor和CTGF之间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pmTor的表达

pmTor在38例结节性甲状腺肿伴乳头状增生中pmTor阳性表达9例(23.7%)，48例甲状腺滤泡上皮非典型增生中pmTor阳性表达11例(25.6%)，58例PTC 组织中pmTor阳性表达28例(56.0%)，经χ2检验，差异有统计学意义(P=0.015)。pmTor在良性滤泡上皮细胞、滤泡上皮非典型增生组织中有不同程度的阳性表达，在PTC组织中阳性表达率更高，滤泡上皮非典型增生与PTC组织中pmTor阳性表达率差异有统计学意义(P=0.021)，见表1。见图1～3。

图1 pmTor在结节性甲状腺肿伴乳头状增生组织中阴性表达(×200)

2.2 CTGF的表达

CTGF在结节性甲状腺肿伴乳头状增生组织中CTGF阳性表达8例(21.1%)，滤泡上皮非典型增生组织中CTGF阳性表达17例(39.5%)，在PTC组织中CTGF阳性表达33例(56.9%)，3组比较差异具有统计学意义(P=0.002)。CTGF在良性滤泡上皮细胞、滤泡上皮非典型增生组织中有不同程度的阳性表达，在PTC中阳性表达率更高，但滤泡上皮非典型增生与PTC组织中CTGF阳性表达率统计学意义(P>0.05)，见表1。见图4～6。

表1 pmTor、CTGF在PTC、非典型增生、结节性甲状腺肿伴乳头状增生中的表达(克鲁斯卡尔-沃利斯秩和检验)

图2 pmTor在甲状腺滤泡上皮非典型增生组织中阳性表达(×200)

图3 pmTor在PTC组织中阳性表达(×200)

图4 CTGF在结节性甲状腺肿伴乳头状增生组织中阴性表达(×200)

图5 CTGF在甲状腺滤泡上皮非典型增生中阳性表达(×200)

图6 CTGF在PTC组织中阴性表达组织中阳性表达(×200)

2.3 58例PTC中pmTor和CTGF阳性表达的关系

Spearmon秩相关检验显示，在58例PTC组织中21例患者pmTor和CTGF在肿瘤组织中同时表达阳性，pmTor和CTGF的表达呈正相关，相关系数rs=1.00(P=0.007)，见表2。当|r|<0.4提示两个变量间为弱相关性，0.4<|r|<0.75为中等相关，|r|>0.75为强相关。本研究结果显示，在58例PTC组织中pmTor和CTGF的表达呈强正相关。

表2 pmTor、CTGF在PTC中表达的相关性

3 讨论

mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标)，也称为FRAP(FKBP12-雷帕霉素相关蛋白)，是一个289 kDa(千道尔顿)的丝氨酸/苏氨酸激酶[6]，mTOR由7650个核苷酸构成2550个氨基酸组成，其基因位于1p36.22[7]。mTOR是一种调控蛋白，属于PI3K相关蛋白激酶(PIKKs)家族，其C末端与PI3K的催化结构域具有很强的同源性[8,9]， mTOR为PI3K/AKT信号通路的下游效应因子，其可被PI3K突变、RAS及MAPK信号通路、生长因子、营养素、压力等刺激激活，参与PI3K / AKT / mTOR途径，进而在细胞存活，细胞骨架重排，侵袭，迁移，抗细胞凋亡和抑制自噬中发挥作用[10]。研究发现mTor在头颈部及阴茎的鳞癌、尿路上皮癌、乳腺癌、滑膜肉瘤、黑色素瘤等多种肿瘤组织中表达增高[8,9,11～14]。此外，mTor还可增加甲状腺细胞对碘的摄取，以促进甲状腺细胞的增殖和存活[15]。pmTor在PTC组织中较癌旁组织呈高表达，高表达的CTGF与PTC甲状腺外转移及淋巴结转移有关。甲状腺滤泡上皮发生非典型增生可能是甲状腺良性病变向PTC发生的早期事件，应该引起我们更多的关注。我们的研究发现，pmTor在PTC中的阳性率高于结节性甲状腺肿伴乳头状增生、滤泡上皮非典型增生组织，差异具有统计学意义。且在结节性甲状腺肿、滤泡上皮非典型增生、乳头状癌中pmTor阳性表达率是递增的，推测pmTor在结节性性甲状腺肿良性病变向PTC发展过程中可能起重要的作用。可作为滤泡上皮非典型增生和PTC鉴别诊断的筛选指标。

CTGF又名CCN2，人类的CTGF基因位于6q23.1，属于CCN 家族的一员，最早从人脐静脉血管基因库中克隆出来，病理状态下可由内皮细胞及成纤维细胞、平滑肌细胞合成分泌后，作为细胞外基质(ECM)与细胞因子间信号传导调节中的蛋白质，促进细胞黏附和迁移，使基质重塑，从而导致成纤维细胞增殖及器官组织纤维化的发生。我们实验中CTGF在结节性甲状腺肿伴乳头状增生中的阳性表达率与滤泡上皮非典型增生组和PTC组织中表达比较差异有统计学意义。在滤泡上皮非典型增生组和PTC组织中CTGF阳性表达率比较差异无统计学意义。滤泡上皮非典型增生与PTC具有同样的CTGF蛋白表达，推测两者可能有密切的内在联系。

Spearman等级相关性分析发现pmTor 与CTGF在PTC中表达具有正相关性，推测二者在PTC发展中可能起重要作用。对PTC的发展具有重要的意义。迄今为止，关于pmTor 与CTGF共同表达在PTC中的关系尚未见相关报道。本研究通过Spearman等级相关性对PTC中pmTor 与CTGF表达进行对比发现，pmTor 与CTGF的表达具有正相关性，表明pmTor 与CTGF均可参与PTC的发生、发展，二者在PTC发展中可能起共同参与作用。但两者相互作用的分子机制现仍未可知。pmTor 与CTGF在人甲状腺乳头状癌细胞水平上是否有相互作用，有待于分子及细胞学实验证实。

综上所述，pmTor 与CTGF均可参与PTC的发生、发展。且二者在PTC发展中可能起共同参与作用。对于早期诊断和筛选PTC，pmTor是有效的蛋白标志物。pmTor 与CTGF在人甲状腺乳头状癌细胞水平上的相互作用，有待于进一步探索。