数字序列分析对两种大蒜总氨基酸测定方法结果间的相关性研究

摆富叶，张婷婷，刘睿婷,2，李兰兰，李乔乔，安泽冲，王 岩，李新霞

（1新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011；2新疆大蒜药用研究重点实验室，乌鲁木齐 830013）

大蒜（Allium SativumL.）为百合科或葱科葱属植物蒜的地下鳞茎，富含多种氨基酸[1-2]，具有抗氧化[3-4]，保护肝脏、降低血小板凝集[5]、增强免疫力[6]、抗辐射[7]、抗炎[8-9]、抗肿瘤[10-11]等功效，多用于抗肿瘤治疗，其中的精氨酸还具有免疫调节及抗氧化功能[12-15]。目前测定氨基酸的方法主要有光谱法、色谱法和氨基酸分析仪直接分析法[16-17]。光谱法采用茚三酮显色法测总氨基酸，其原理是茚三酮将α-氨基酸氧化成亚氨基后水解成氨与还原的茚三酮和茚三酮之间发生缩合，产生蓝紫色产物，根据这个有色反应产物进行可见光谱法定量。在植物中有多种氨基酸，根据反应原理采用一个氨基酸对照品为替代，以它计总氨基酸含量是一个经典的方法，它的优点是快速、节省对照品，方法的稳定性好，易于操作，适用于大样本量对总氨基酸含量数据有需求的分析测定。色谱法常采用柱前衍生化，异硫氰酸苯酯（Phenyl isothiocyanate，PITC）为柱前衍生氨基酸分析常用试剂，该法可以测定每一种氨基酸的具体含量，但操作冗长，检测成本较高。氨基酸分析仪只能测定18种已有对照品的氨基酸，但特殊氨基酸，如蒜氨酸不包括在内，且仪器价格相对昂贵。数字序列相关性分析法[18]是判断两个序列是否具有线性或拟线性关系的方法。本研究采用茚三酮显色-可见分光光度法（茚三酮显色-Vis 法）和PITC 衍生化-HPLC 法（HPLC 法）分别测定大蒜总氨基酸的含量，采用数字序列相关分析法分析两种测定方法间的相关性，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器LC-2030C 3D Plus 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；UV2550 紫外分光光度计（日本岛津公司）；AB135-S分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 试剂对照品：天冬氨酸（百灵威，批号L660Q23），谷氨酸（百灵威，批号LQ80Q22），丝氨酸（百灵威，批号LD10Q112），甘氨酸（百灵威，批号L6C0Q29），组氨酸（百灵威，批号L650Q40），精氨酸（百灵威，批号L280Q27），苏氨酸（百灵威，批号LB50P24），丙氨酸（百灵威，批号LR40Q23），酪氨酸（百灵威，批号LT60Q16），缬氨酸（百灵威，批号L330Q56），苯丙氨酸（百灵威，批号LG50Q57），蛋氨酸（百灵威，批号LK70Q23），赖氨酸（百灵威，批号LR60Q15），天冬酰胺（百灵威，批号L280Q59），脯氨酸（百灵威，批号LE30Q108），亮氨酸（百灵威，批号L210Q38），色氨酸（百灵威，批号LL90Q74），S-烯丙基-L-半胱氨酸（东京化成，批号J4ZFO-JK），S-甲基-L-半胱氨酸（东京化成，批号KNGB J-I C），蒜氨酸（新疆埃乐欣，批号AL160526），正己烷（天津天新，批号20180710），茚三酮（中国医药，批号20040318），磷酸二氢钾（天津致远，批号2019062059），三乙胺（天津光复，批号20110509），磷酸氢二钠（天津致远，批号201907205），异硫氰酸苯酯（百灵威，批号T7530），乙酸钠（天津福晨，批号20140804），冰醋酸（天津富宇，批号20120911），乙腈（美国Sigma）、甲醇（美国Sigma）。

1.3 药材大蒜于2021年8月-9月购买自11个产地（1-托克逊乡十大队秋播大蒜、2-康其乡大蒜、3-黑英山五大队大蒜、4-托克逊乡九村秋播大蒜、5-托克逊乡十大队春播大蒜、6-托克逊乡九村春播大蒜、7-察合哥镇四大队秋蒜、8-托克逊乡一村春播大蒜、9-托克逊乡一村秋播大蒜、10-大桥乡五村大蒜、11-察合哥镇四大队春蒜）；大蒜粉于2018 年10 月24 日购买自23个产地（12-甘肃武威（紫皮蒜）、13-青海西宁（独头蒜）、14-河南、15-青海西宁（白蒜）、16-山东（巴里坤种植）、17-甘肃武威（独头蒜）、18-青海西宁（红蒜）、19-新疆拜城县、20-新疆昭苏、21-山东（紫皮蒜）、22-李寨三社、23-新疆且末（大蒜）、24-新疆巴里坤（第一批次）、25-新疆且末（高原香蒜）、26-新疆且末（香蒜）、27-名联十二社、28-甘肃酒泉（第一批次）、29-新疆塔城、30-新疆巴里坤（第二批次）、31-新疆三棵树（第四批次）、32-新疆吉木萨尔、33-甘肃酒泉（第二批次）、34-甘肃民乐），经冷冻干燥后获得大蒜的冻干粉。

2 方法与结果

2.1 茚三酮显色-Vis法测定大蒜总氨基酸的含量

2.1.1 溶液的配制 磷酸盐缓冲液的配制(pH8.0)：取0.9 %磷酸二氢钾溶液10 mL 加入2.4 %磷酸氢二钠溶液190 mL混匀即得。2%茚三酮溶液的配制：称取2.0 g 茚三酮置于锥形瓶，加入70 mL 蒸馏水溶解，加入氯化亚锡80 mg，过滤，蒸馏水定容至100 mL，备用。氨基酸对照品溶液的配制：称定精氨酸对照品0.1 g 置于50 mL 量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，即得（每1 mL中约含精氨酸2.0 mg）。

2.1.2 供试品溶液制备 大蒜经冻干粉碎获得蒜粉，称取大蒜粉0.5 g 置于50 mL 量瓶中，加5 mL 甲醇超声10 min，加水定容至刻度，摇匀，离心，取上清液备用。称取大蒜100 g 于500 mL 的烧杯，加水200 mL煮沸10 min，匀浆，转移至500 mL 容量瓶，加水定容至刻度，离心，取上清备用。

2.1.3 实验方法 量取1.0 mL 供试品或对照品溶液，置于20 mL 具塞试管中，加磷酸盐缓冲液（pH8.0）至5.0 mL，加1.0 mL 2%茚三酮溶液，80℃水浴30 min，放置室温，加水至16.0 mL。以相应的试剂为空白，测定567 nm处的吸光度。

2.1.4 回归方程的建立 根据实验需求量取精氨酸对照品溶液0、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 和2.0 mL，分别置20 mL 具塞试管中，按“2.1.3”项下方法测定，以浓度和吸光度分别为横纵坐标，建立回归方程：Y=0.004 2X-0.640 1，r=0.999 5。结果表 明，在200.00～400.00 μg/mL范围内氨基酸的质量浓度与吸光度线性关系良好。

2.1.5 精密度实验 量取供试品溶液6 份，按“2.1.3”项下方法操作，结果精密度RSD＜2%。

2.1.6 稳定性实验 按“2.1.3”项下方法操作，每隔5 min 测定1 次已反应完毕的供试品溶液，连续测定45 min。结果表明，在45 min 内氨基酸与茚三酮反应产物的吸光度稳定。

2.1.7 加样回收率实验 按1:1 加入精氨酸对照溶液（0.3 mg/mL）于供试品溶液(5.002 mg/mL)（n=6）中，按“2.1.3”项下方法操作，结果显示加样回收率在95.0%～105.0%范围内，RSD＜2.0%。

2.1.8 含量测定分别称取31 批不同批号的大蒜样品（n=3），按“2.1.3”项下方法操作，测定567 nm 处吸光度，以精氨酸计大蒜总氨基酸含量，见表1。

表1 茚三酮显色-Vis法和HPLC法测定31批大蒜总氨基酸含量及数据变换结果

2.2 HPLC法测定大蒜总氨基酸的含量

2.2.1 溶液的配制 对照品溶液的配制：称取适量各氨基酸对照品，加水溶解并稀释至所需浓度（天冬氨酸：151.44 μg/mL，谷氨酸：146.76 μg/mL，丝氨酸：82.08 μg/mL，甘氨酸：80.96 μg/mL，组氨酸：78.56 μg/mL，精氨酸：1002.14 μg/mL，苏氨酸：161.04 μg/mL，丙氨酸：159.88 μg/mL，脯氨酸：161.52 μg/mL，酪氨酸：80.44 μg/mL，缬氨酸：149.12 μg/mL，蛋氨酸：131.56 μg/mL，亮氨酸：80.36 μg/mL，苯丙氨酸：148.40 μg/mL，色氨酸：79.52 μg/mL，赖氨酸：151.72 μg/mL，S-烯丙基-L-半胱氨酸：98.28 μg/mL，S-甲基-L-半胱氨酸：80.72 μg/mL，天冬酰胺：98.80 μg/mL），备用。蒜氨酸对照品溶液的配制：称取蒜氨酸对照品适量，用50%甲醇配制成浓度为368 μg/mL的溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液的配制 鲜蒜经冻干得蒜粉，取各产地蒜粉100 mg 置于10 mL 容量瓶中，加5 mL 甲醇超声10 min，用水定容至刻度，即得。大蒜供试品溶液配制见“2.1.2”。

2.2.3 色谱条件 色谱柱：日本岛津VP-ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相A：pH6.5 乙酸钠溶液（1 000 mL-乙腈70 mL）；流动相B：甲醇-乙腈-水(20∶60∶20)，检测波长254 nm，流速1.0 mL/min，柱温35℃，进样量10 μL，按流动相A：0～5 min，98%；5～6 min，95%；6～14 min，91%；14～18 min，79%；18～32 min，55%；32～34 min，45%；34～38 min，0%，程序洗脱，见图1。

图1 20种氨基酸对照品HPLC色谱图

2.2.4 含量测定 取供试品溶液，衍生化处理，按“2.2.3”项下色谱条件测定，以外标法对各氨基酸含量进行计算，各氨基酸含量结果之和为大蒜总氨基酸含量，结果见表1。

2.3 建立茚三酮显色-Vis 法和HPLC 法测定大蒜总氨基酸相关性数学模型采用数字序列相关性分析法建立茚三酮显色-Vis 法和HPLC 法测定大蒜总氨基酸结果是否具有相关性的数学模型，用相关系数Cμ1·μ2、r来判断。

按不同方法分别计算相关系数得：

式中:Cμ1·μ2，r为相关系数，μ1、μ2和x、y 为变量，μ1=xi/maxxi，μ2=yi/maxyi），xi和yi分别是茚三酮显色-Vis 法和HPLC 法测定大蒜总氨基酸含量；maxxi和maxyi分别是茚三酮显色-Vis法和HPLC 法测定大蒜总氨基酸含量中的最大值，x和y分别是茚三酮显色-Vis 法和HPLC 法测定大蒜总氨基酸含量变换结果。按照Cμ1·μ2相关程度判定：若|Cμ1·μ2|＜0.5，无明显相关性；若|Cμ1·μ2|≥0.9，有相当明显相关性。按照r相关程度判定：若0.7≤|r|＜1，高度相关；若|r|＜0.4，低度相关。本研究将茚三酮显色-Vis 法和HPLC 法两种方法的测定数据按μ1=xi/maxxi，μ2=yi/maxyi进行数据变换，见表1。将表1 数据按照公式（1）和（2）计算得：Cμ1·μ2=0.921 7，r=0.932 0，表明测定大蒜总氨基酸含量所采用的茚三酮显色-Vis 法和HPLC 法具有“相当明显即高度相关性”，拟合出线性方程：Y=1.003 3X+2.278 1，r=0.932 0，且P＜0.01，说明相关性具有显著性意义，见图2。

图2 两法测定大蒜总氨基酸含量的回归曲线

2.4 相关性数学模型的验证随机抽取3 批大蒜粉进行茚三酮显色-Vis 法和HPLC 法测定大蒜总氨基酸含量，所得数据用本文建立的相关性数学模型分析，验证相关性数学模型的适用性。结果表明茚三酮显色-Vis 法测得的大蒜粉总氨基酸含量测算HPLC 法测得的大蒜粉总氨基酸含量，与HPLC 法测得的大蒜粉总氨基酸含量的真实值比较，绝对值误差较小，说明该相关性数学模型具有较高的适用性，见表2。

表2 相关性数学模型的验证

3 讨论

茚三酮显色-Vis 法的原理是含有伯氨基的氨基酸经茚三酮氧化为游离氨，再与茚三酮及还原性茚三酮缩合成蓝紫色产物，根据该产物的吸收波长进行定量测定，因此不论氨基酸是何种结构，只要含有伯氨基，均可定量转化为游离氨，可以反映含有伯氨基的氨基酸总含量。本研究采用20种氨基酸对其经茚三酮氧化后缩合产物的光谱分别进行了扫描，对缩合反应条件进行了考察，是稳定可靠的，故选择567 nm 为测定波长。但无法检测到脯氨酸和天冬酰胺在567 nm 处的最大吸收峰，因脯氨酸是没有伯氨基的，与茚三酮反应产生黄色物质；天冬酰胺则因为另外含一个酰胺基可与茚三酮反应，生成棕色产物。因此任选一种含有伯氨基的氨基酸，就可以采用茚三酮显色-Vis 法对总氨基酸进行含量测定。本研究以精氨酸为对照品，是因为精氨酸与蒜氨酸占大蒜总氨基酸含量的80%以上，精氨酸约为总氨基酸的49%，而精氨酸与蒜氨酸相比易获得、更经济，以精氨酸为对照品采用茚三酮显色-Vis 法测定大蒜总氨基酸是可靠的，缺点是不知道各氨基酸分别是多少。

茚三酮显色-Vis 法和HPLC 法测定大蒜总氨基酸结果通过数字序列相关性分析法建立相关性数学模型，并由茚三酮显色-Vis 法测得的大蒜总氨基酸结果预测大蒜总氨基酸结果，验证数据的结果表明结果是可行的。HPLC 柱前衍生化可以得到每一种氨基酸（只要有对照品）的含量，相加后就是总氨基酸含量。对于大蒜来说，蒜氨酸是特征氨基酸需要采用HPLC 方法获得含量，课题组已经建立了非衍生化的测定方法，较为简便，如果再采用茚三酮显色-Vis 法结合数学模型获得总氨基酸含量，就可以评价大蒜氨基酸的情况。经HPLC 法测定脯氨酸和天冬酰胺仅占总氨基酸含量的0.57%，是两种方法误差的原因之一，但影响不大。

本研究从原理和大批量数据测定结果及数学模型分析均显示测定大蒜样品中总氨基酸含量的茚三酮显色-Vis 法相对HPLC 法更快速更经济，可以结合蒜氨酸HPLC 法测定结果控制和评价大蒜样品原料的质量，本研究采用数字序列相关性分析评价该方法替代HPLC 柱前衍生化法测定大蒜总氨基酸的可靠性是有意义的。