内脂素基因rs13237989多态性对HBV相关性肝病发病风险的影响*

伍志通，叶慧芬，向文耀(贵港市人民医院.检验科，.感染科，广西贵港 537100)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第六大最常见的恶性肿瘤和第三大癌症死亡原因，中国是世界上HCC发病率最高的国家[1]。遗传因素特别是基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)影响肝癌的发生发展。近年研究表明，一些基因的SNP与HBV相关性HCC的发病风险密切相关[2-3]。

内脂素(visfatin)是一种在内脏脂肪组织中高表达的脂肪细胞因子，与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移密切相关。通过基因筛查发现，人类visfatin基因存在多个SNP位点，已有研究表明visfatin rs61330082、rs2505568等SNP与膀胱癌[4]、食管癌[5]、非小细胞肺癌[6]、胰腺癌[7]等多种癌症发病风险相关。研究表明，visfatin rs61330082基因多态性可能与广西壮族人群HBV相关HCC风险降低有关[8]。然而，visfatin rs13237989基因多态性与慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)、HBV相关肝硬化(liver cirrhosis, LC)和HCC的发病风险是否相关，目前尚未见报道。本研究评估visfatin rs13237989基因多态性与CHB、HBV相关LC和HCC的发病风险之间的关系，以期为HCC的早期预测提供一个新的潜在靶点。

1 材料和方法

1.1研究对象 选取2019年8月至2019年11月贵港市人民医院收治的434例无血缘关系且连续入选的HBV相关性肝病患者。其中，CHB 140例，HBV相关性LC 143例，HBV相关性HCC 151例。所有患者乙肝病毒表面抗原(HBsAg)检测呈阳性超过6个月。CHB组和LC组患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》诊断标准[9]，HCC组患者符合《原发性肝癌诊疗规范(2017 年版)》的诊断标准[10]。CHB定义为HBV DNA阳性且血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)在6个月内持续升高。随机选取同期在本院体检中心进行常规体检的132名健康志愿者作为对照组。所有健康受试者均未感染HBV，肝功能检查正常。本研究获得研究对象知情同意，并经过贵港市人民医院医学伦理委员会批准(GYLLPJ-20200622-08)。

1.2主要仪器和试剂 梯度PCR仪Easy Cycler(德国AnalytikJena公司)；全自动化学发光/荧光图像分析系统5200Multi(上海天能公司)；3730XL型测序仪(美国ABI公司)。AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒(康宁生命科学公司)；Hotstart HiTaq DNA聚合酶(上海生工公司)；dNTP(加拿大Fermentas公司)；SNaPshot Multiplex Kit(美国Thermo Fisher Scientific公司)；SAP酶和ExoⅠ酶(哈尔滨海基公司)。

1.3SNP位点的选择 检索基因多态性的NCBI公共数据库，查阅visfatin SNP的种类，选择在中国人群次要等位基因频率(MAF)>0.05且已有报道或能引起机体生物学效应的SNP。最终选取rs13237989作为广西地区HBV相关性HCC的研究位点。

1.4DNA提取和SNP分型 收集研究对象外周静脉血2 mL，采用AxyPrep DNA提取试剂盒提取DNA。依据GenBank收录的visfatin基因序列，使用Primer Premier 5.0软件设计PCR扩增引物，并由广州擎科生物技术有限公司进行合成。PCR扩增上游引物序列为5′-GCAATAGAAGCCAAATGAG

A-3′，下游引物序列为5′-ATTATTTAGCCTCCTCCC

TT-3′ 。用多重PCR技术扩增目的DNA序列，扩增反应总体积为10 μL，包含5×buffer(15 mmol/L Mg2+) 2 μL，Solution I(10×)1 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 0.8 μL，HotStar HiTaq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O补足至10 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 15 min；15个循环(94 ℃ 40 s，63 ℃开始每循环递减0.5 ℃ 1 min，72 ℃ 8 min)；25个循环(94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5 min)；72 ℃ 8 min。对获得的PCR产物进行纯化，反应体系包含3 μL PCR扩增产物，10×SAP Buffer 0.4 μL，SAP酶(5 U/μL) 0.2 μL，10×ExoI Buffer 0.4 μL，ExoI酶(20 U/μL) 0.05 μL。37 ℃温浴1 h，然后75 ℃保温15 min以灭活SAP和ExoI酶。使用多重单碱基延伸技术(SNaPshot)确定rs13237989的基因型，以纯化后的PCR产物作为SNaPshot PCR的模板进行反应，配制反应混合液5 μL，其中包括2 μL PCR反应液，1 μL SNaPshot Pooled PCR产物，1 μL延伸引物，ddH2O补足至5 μL。SNaPshot PCR延伸引物由广州擎科公司进行合成，序列为5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACCACTGCAATAAAGCAAGTCA-3′。PCR反应条件为：96 ℃ 2 min，25个循环(96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)，保温温度为4 ℃。在5 μL上述SNaPshot PCR产物中加入0.5 U SAP，震荡混匀，37 ℃保温1 h，75 ℃失活15 min。然后将纯化后的SNaPshot PCR产物送广州擎科公司用3730XL型DNA序列检测仪进行测序，使用GeneMarkerV1.91软件分析结果。

1.5统计学分析 用SPSS 16.0软件进行。采用方差分析、χ2检验比较基线资料(年龄、性别)。采用拟和优度χ2检验分析各组中实际检测的基因型频率分布是否符合哈-温(Hardy-Weinberg，HWE)平衡定律，P>0.05被认为各基因型的分布符合HWE平衡。采用χ2检验和Fisher确切概率法分析各基因型、等位基因频率在各组中分布是否有差异。采用非条件Logistic回归分析，校正年龄、性别等因素，计算OR值和95%可信区间(CI)，比较各组样本基因型和等位基因、构建的显性模型和隐性模型与CHB、LC和HCC之间的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1研究对象的基本情况 各组男女性别匹配(P均>0.05)。CHB组年龄偏低，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，LC组、HCC组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 研究人群的基本特征

2.2Visfatin rs13237989与HBV相关性HCC发病风险的关系 Visfatin rs13237989在CHB、LC、HCC和健康人群中的基因型和等位基因频率分布见表2。Hardy-Weinberg平衡检验结果显示，这4组的基因型频率均与HWE的预测一致(P>0.05)，表明本研究对象具有群体代表性。对rs13237989 位点多态性与CHB、LC和HCC发病风险之间的关系进行Logistic回归分析，校正性别和年龄2个因素的影响后，未发现rs13237989位点的任何遗传模型与CHB、LC和HCC的发病风险相关(P均>0.05)。

表2 Visfatin基因多态性在病例和对照组间的相关性分析

2.3Visfatin rs13237989与HBV相关性HCC发病风险的性别分层分析 性别分层后，通过Logistic 回归分析，校正年龄后结果显示，在男性人群中，以CC基因型为参照，TT基因型与CHB的发病风险降低相关(OR=0.400，95%CI：0.176～0.911,P=0.029),但与LC、HCC的发病风险无关(P>0.05)。以C等位基因为参照，T等位基因与CHB的发病风险降低相关(OR=0.639，95%CI：0.426～0.959，P=0.031),但与LC、HCC的发病风险无关(P>0.05)。显性模型分析中，以CC基因型为参照，CT+TT基因型与CHB、LC和HCC发病风险无关(P>0.05)。隐性模型分析中，以CC+CT基因型为参照，TT基因型与CHB(OR=0.454，95%CI：0.216～0.954，P=0.037)的发病风险降低相关,但与LC 和HCC的发病风险无关(P>0.05)，见表3。女性人群中，未发现rs13237989位点的任何遗传模型与CHB、LC、HCC的发病风险相关(P均>0.05)，见表4。

3 讨论

本研究首次对广西地区人群visfatin rs13237989基因多态性与CHB、HBV相关LC和HCC的发病风险进行研究。结果显示，rs13237989位点的任何遗传模型与CHB、LC和HCC的发病风险无关，提示此位点在HBV相关HCC患者的病程进展过程中无明显影响。然而，经性别分层分析后发现，TT基因型、T等位基因和隐性模型(TT vs CC+CT)与男性人群CHB的发病风险降低相关，但与LC和HCC的发病风险无关。显性模型(CT+TT vs CC)与CHB、LC和HCC发病风险无关。而在女性人群中，未发现rs13237989位点的任何遗传模型与CHB、LC和HCC的发病风险相关。这种差异的原因可能是由于男性和女性的体脂成分和性激素水平不同引起的[11]。

Visfatin(或NAMPT)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生物合成的重要限速酶，催化烟酰胺(NAM)转化为烟酰胺单核苷酸(NMN)。由于NAD作为辅酶调节糖酵解、丝氨酸生物合成和脂肪酸氧化等多种代谢信号通路，NAD的不断产生促进了癌细胞的生存和增殖[12]。研究发现，NAMPT在HBV阳性肝癌细胞中的表达水平明显高于HBV阴性肝癌细胞，且这种作用依赖于HBV X蛋白，NAMPT通过调节有氧糖酵解促进HBV复制和HBV介导的肝癌细胞的增殖，从而在HBV相关HCC发生发展中发挥重要的作用[13]。rs13237989位点位于visfatin基因内含子上，研究发现，内含子突变会影响基因剪接，继而对基因表达起调控作用[14]。因此，研究该位点的基因多态性对于深入了解visfatin参与的疾病具有重要的意义。

表3 男性人群visfatin基因多态性在病例和对照组间的相关性分析

表4 女性人群visfatin基因多态性在病例和对照组间的相关性分析

目前，只有一项研究报道了visfatin rs13237989基因多态性与疾病发病风险的关系。Zhou等[15]研究发现，visfatin rs13237989基因多态性影响胰岛素水平和糖尿病指数，但与2型糖尿病发病风险无关。另外，目前国内外还有一些关于visfatin其他位点的基因多态性与癌症相关性的报道。本课题组曾研究发现visfatin rs61330082多态性可能与广西壮族人群HBV相关HCC风险降低有关[8]，有研究发现visfatin rs61330082 CC基因型和C等位基因显著增加膀胱癌的发病风险，rs2505568 A等位基因和AT基因型显著降低膀胱癌的易感性，然而，rs9034基因多态性与膀胱癌之间的相关性无统计学意义[4]。此外，研究发现，visfatin基因rs61330082 CC基因型和C等位基因可增加食管癌的发病风险,而rs2505568和rs9034与食管癌发病风险无关[5]。另一项研究发现，visfatin基因rs61330082 CC基因型增加非小细胞肺癌发病风险，而CT、TT基因型和C等位基因降低非小细胞肺癌发病风险[3]。以上结果与本研究结果不完全一致，提示基因的不同SNP与不同人群或疾病的发病风险不同。

本研究仍有不足之处，由于本研究样本仅来自本地区人群且样本量有限，visfatin基因rs13237989位点与HBV相关HCC风险之间的关联可能受地域及样本量的限制。因此，本研究的发现仍需要在多中心、多民族、大样本研究中进一步证实，并且通过体外功能实验进行验证。