植物组织培养中褐化现象控制方法分析

张梅 杨燕 盛鹏 顾晓颖

摘    要：细胞若是受到损坏，会破坏细胞区隔作用，同时氧化物醌类物质和毒性酚类物质均会使组织发生褐变，使植物组织培养失败。在组织培养中，褐变情况是由外植体材料、生理状态、培养条件等因素共同决定的，对此可实施低温培养、添加抗氧化剂、勤转瓶的方式把控褐变。文章主要阐述植物组织培养中褐化现象控制方法，以供参考。

关键词：植物;组织培养;褐化现象;控制方法

文章编号：1005-2690（2022）03-0091-03       中国图书分类号：Q943.1       文献标志码：B

植物组织培养主要应用在种质资源保存、无病毒苗木培育和植物离体快繁等内容中，但也会有培养物或者外植体褐化现象。褐化属于植物组织培养的现象，决定组织培养的最终结果。因此要结合实际情况制订不同的解决措施，同时在实践中进行探索，找到理想化的防褐方法，以便于实现最佳效果。

1 褐化相关概述

褐化现象是指在植物组织培养中，外植体由于自身分泌的酚类化合物的影响导致外植体褐变褐化，是植物组织培养中一种常见的现象，直接影响到组织培养能否取得成功。多酚氧化酶氧化为醌类物质，使酶的活性受到抑制，培养材料无法正常生长，甚至会出现死亡。探究外植体褐化可知，褐化作用根据生物基发生机制可划分为两种：非酶促褐化和酶促褐化。酶促褐变是植物组织培养中产生的褐化现象，多数是由酶促褐变所引发，常见的是多酚氧化酶，在天然底物酚类物质下产生。通常情况下，细胞中含有的醌类和酚类物质，两种物质处于动态平衡。醌类物质水平低，氧化酶和底物会在细胞的各部位平分，酚类物质在细胞的液泡内分布，而酶储存于细胞质和其他质体内，此种区域性分布质膜会将酶和底物分开。培养材料和外植体会分布在细胞膜结构、细胞衰老区域中，会损坏释放或合成的氧化酶，若是此时的温度和pH值合适，则酚类物质和酚氧化酶会有酶促氧化反应出现，形成棕褐色醌类物质，进而产生褐变。同时组织病变或老化，也会使酚氧化酶出现激活，而产生褐变。

非酶促褐变指的是细胞由于受到胁迫等不利条件因素的影响，使细胞出现了死亡或程序化死亡的情况，此种情况便会出现褐变，不会产生酚类物质，这些不利条件均会使细胞产生程序化的死亡，因此要实施有效措施，确保愈伤组织不会发生褐变。

深入探究酶和底物，进而研究酶促反应体系。在组织培养中，酚类物质含量和褐化率有直接关系，酚类物质若是在正常的植物组织发育时，不会有褐变出现。

2 褐化影响因素

在植物组织培养中，经常会有褐化现象产生。植物材料出现褐变因素多种多样，要注意以下几点内容。

2.1 培养基组成

培养基成分决定培养外植体的褐变与集合化程度。第一，激素类型和浓度比例。培养基中褐变受植物生长的类型、浓度影响，培养基中的激素类型搭配不同，褐化程度也存在差异。细胞分裂素的物质会使褐化产生，生长素也能延缓酚类物质的合成，避免发生褐化。培养基中激素浓度高，也会加速褐化的产生。培养过程中杂质较多的白糖会有严重的褐化，甚至出现死亡，而化学蔗糖纯度较高，褐化率低。由此可知，以葡萄糖作为碳源开展的培养工作，能避免发生褐化。因此，糖类也会使褐化受到影响，培养基中的附加成分也影响褐化产生。若是发现有谷氨酰胺或水解酪，则对褐化产生有利。第二，无机盐的含量和类型。在培养基中，无机盐的浓度和类型影响外植体生长，因此培养基中含有的无机物可能是氧化酶合成所必备的。若是无机盐浓度高，则会使外植体酚类外溢出现氧化，加速产生褐化的效率。由此可知，盐分大，褐化程度高，外植体在各培养基上出现褐化不同[1]。

2.2 外植体情况

第一，材料大小。材料的年龄与组织影响褐化程度，如果外植体老化程度高，会提高木质素含量，容易产生褐化，因此外植体成龄材料要比幼龄材料的褐化程度高，使用桑树基部的幼芽褐化程度低于上部的枝条壮芽褐化程度，外植体产生的褐化程度轻，幼龄树产生的褐化率低。时间短的材料，组织培养容易成功，时间长的材料，植物胚需要完整接种胚珠，避免随着成熟度的上升，加重褐化程度。外植体大小影响褐化性，主要是材料越小越容易有褐化产生;材料大，则产生的褐化程度轻。切口大，酚类物质容易被氧化，加速褐化的程度。而植物茎尖越短，褐化越严重，植物茎尖越长，褐化程度越轻。第二，取材的位置和时间。植物酚类化合物，多酚氧化酶的活性在各季节有不同变化，通常情况下，生长季节酚类化合物含量多，活性高。冬季褐化率低，而夏季和秋季會加速褐化产生，接种后存活率较低。而6月和9月属于植物生长的旺盛期，会加速褐化率。在取材位置上可发现，幼嫩茎枝通常不会有褐化产生，而木质化程度高的位置在使用药剂处理会加速褐化的产生。第三，消毒情况。在接种时，化学消毒剂会伤害到外植体，从而引发褐化，消毒剂和消毒时间存在差异，外植体也会出现不同程度的伤害，甚至会有褐化出现。消毒时间长、效果好，但会产生褐变。消毒时间长，褐化效率高，只有将消毒时间需要控制在合理范围内，才能使外植体成活率得到保证。消毒后使用磁力搅拌器，将材料充分清洗，有效减轻褐化[2]。

2.3 培养条件

第一，温度。温度高会加速发生褐化，高温下能够增加酶的活性，使酚类物质出现氧化，导致外植体褐化。由试验可知，高温培养能使褐化率接近53%。低温条件下，褐化率接近30%。

第二，光照。光照强度影响褐化的情况以及褐化发生的概率。外植体褐化在黑暗情况下比较严重，在光照的情况下，外植体褐化轻。黑暗情况下，培养产生的褐化晚，程度轻。若是光强小于标准要求，会加速外植体产生的褐变，则植株会出现褐化情况，这是由于光照少，减少外植体的生理活力，加速了褐化程度。因此光强培养能减少外植体褐化率，各光照下产生的褐化程度也存在着差异。

第三，培养时间。培养时间的长短影响褐化的情况。由实践可知，转瓶时间早和晚影响褐化率。15 d转瓶1次，会保证茎正常生长并且色泽正常。同时培养基中不会有浑浊物出现。若是25 d转瓶1次，则植株体颜色暗淡，甚至培养基会有浑浊物出现。30 d转瓶1次，会使植株的颜色暗沉，生长缓慢，培养基浑浊，甚至会释放絮状物，逐渐朝四周扩散。由试验可知，甘蔗愈伤组织会诱导分化苗，在培养过程中加速褐化率[3]。

2.4 基因型

植物中酚类化合物包含的数量以及酶类的活性存在差异，各植物出现褐化的程度以及次数也不同。木本植物酚类化合物含量高于草本植物。在开展组织培养的过程中会发现，木本植物发生褐化率高，相同植物不同品种和类型出现的褐化也存在差异。比如探究柳桉茎段容易产生褐化，杂交茎段会产生较轻的褐化情况，并且植物组织培养中的材料或外植体出现褐化，也是导致培养过程失败的因素之一。材料的生理状态影响接种后褐化的情况，在探究核桃组织培养中可知，若是外植体的木质化程度高，会加速产生褐化。在培养材料时，褐化程度和多酚氧化酶的活性有着直接联系[4]。

2.5 培养基形态

液体培养基能减小发生外植体褐化率，但是对于液体培养基有着严格要求，培养流程烦琐，并且对培养基硬度也有一定要求。培养基硬度大，会降低褐化率，培养基硬度小，会加速褐化的程度。培养基硬度决定扩散酚类物质的效率，外植体受伤害程度分为药剂伤害、机械伤害和培养基伤害，这些因素均影响褐化的情况，同时灭菌时间也影响外植体褐化率。酸性环境使褐变过程受到影响，硬度低的蒸馏水会使褐化严重，甚至会有死亡情况出现，此些情况均使配制培养基水发生了改变，使培养基中无机盐的浓度出现改变，让植物外植体褐化受到影响[5]。

3 控制组织培养褐化措施

3.1 选择合适的材料

外植体的分生能力强，通常在合适的细胞分化培养条件下，外植体能达到旺盛状态，进而减轻褐化的情况。由此可知，选择植株材料最好是幼龄材料，选择植株的部位也要适当，保证材料中含有少量的酚类物质，避免出现褐化状态。在培养胚离体时，将胚珠取出，并且将植株部位剥去进行接种，能有效避免褐化情况产生[6]。

3.2 预处理外植体和母株

第一，实施黑暗预处理。母株可使用遮光处理法降低褐化情况，从而培养母株萌发。比如在培养时，可发现外植体相同，完成培养结束后，重度遮光下的褐化率为60%，而自然光照褐化率为88%，轻度遮光处理下的褐化率为80%。在培养桉树时，可收集碎条使用黑色塑料袋遮盖枝条，避免光线照射，从而降低外植体诱导的褐化率。比较诱导试验可知，褐化率降低了20%。第二，实施低温预处理工作。低温预处理工作能避免褐化产生。苹果与核桃外植体若是在5 ℃下开展低温预处理，则能减轻褐化发生的情况。而红豆杉在45 ℃下实施预处理，能有效克服褐化的情况。

第三，预培养。预培养能减少酚类物质的毒害，同时能收集茎芽，并且在液体培养基上先培养3 d，然后再使用半固体培养基开展培养工作，核桃外植体在含有蔗糖的培养基中培养7 d[7]。

3.3 选择适当的培养基

第一，需要将培养基中的无机离子类型和浓度进行调整。在改良诱导培养基中，未经过改良的培养基效果更好，同时也会降低褐化死亡率。使用改良后的培养基，能减轻褐化的情况。

第二，调整培养基中含有的激素比例和含量。细胞分裂素和生长素浓度高，会刺激桉树外植体的氧化情况，在高浓度外源激素下，会提升诱导的褐化率。低浓度下外源激素也会减少诱导的褐化率。在培养基中添加抗氧化剂，比如常见的抗坏血酸、硫代硫酸钠、血清白蛋白等，在培养时需要在培养基中添加抗坏血酸，确保能有效遏制组织恶化。在培养桦树组织时，添加防腐剂能够有效抑制褐化的情况。

第三，培养基中放入吸附剂。吸附酚类的氧化物，活性炭属于具有较强吸附性的吸附剂，因此需要应用小浓度的活性炭。活性炭能够更好地将酚类氧化物进行吸附。但活性炭吸附无选择性，在吸附酚类氧化物时，也会将其营养物质吸附。比如在培养蝴蝶兰时，可发现活性炭能控制生长，但却无法开展分化工作。组织培养材料会有水解型多酚存在，在培养此类外植体时，会因多酚类物质分泌培养基中，加深培养基颜色，同时将其氧化成醌类物质。多酚类物质和醌类物质抑制酶活性，使外植体无法吸收营养物质。在培养多酚类物质时，要预培养一段时间，确保在培养基中分泌酚类物质[8]。

3.4 转移外植体

加速转瓶效率，及时更换培养基，从而减少在培养材料受到酚类物质的毒害。添加兰花、核桃均能够减少褐化。在培养番茄原生质体时，通过添加培养液能有效遏制褐化的情况。培养红豆杉时需要新鲜培养液，从而刺激外植体，使醌类物质更好地释放，使其能和培养基中的氧气配合。

培养植物组织出现的影响因素多种多样，如培养物自身、环境或者是多种因素共同作用。因此需要先了解相關机制，从而正确认识组织培养产生的褐化现象以及克服的方法。从实践上控制褐化出现，更好地解决组织培养出现褐化的难题，确保组织培养技术逐渐完善。酶促褐有多种物种基因差异，因此在探究褐化物种种群时，要及时开展筛选工作，有效把控恶化情况。由试验可知，褐化是植物适应性的一种反应，因此探究褐化抗病连锁细胞群体的工作有重要意义。植物组织培养中，褐化材料和生根的问题共同存在，在培养组织中也要加强褐化与生根间的联系[9-11]。

3.5 使用消毒剂和时间

开展外植体消毒工作，需要建立培养无菌体系，若是未充分消毒，则会使培养基受到污染，导致外植体死亡。因此选择不合适的消毒剂或消毒时间长，均会毒害外植体，甚至会使细胞受损，加速褐化程度。并且选择消毒的时间和消毒剂也影响母株的类型、取材的位置和环境，各种类的外植体与消毒剂耐受性间存在差异，植物材料成熟对消毒剂耐受性接受能力强，增加带菌量，延长消毒的时间。在培养幼嫩茎段组织时，使用氯化汞对外植体开展消毒工作，处理10 min发现褐化情况变轻，也能正常发芽，消毒试剂使用率高。消毒时间缩短，会发现褐化率变高，因此褐化率与消毒时间呈反比关系。在开展苹果茎段组织培养过程中，发现外植体褐化率随着消毒的时间改变而改变，虽然测试的结果存在差异，可能是组织对象的结构与生理特性存在不同[12-13]。

4 结束语

植物组织培养存在生理状态、取材和培养条件的不同，为避免外植体出现褐化，要采取有效方式。防止褐化的方法和效果存在差异，因此要结合培养的实际情况选择对应方法。要实施多种搭配措施，合理使用外植体预处理，确保获得理想化的防褐效果。

参考文献：

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