鹿不同组织中H-FABP与E-FABP基因的表达1)

郭梦雅 汤吉伟 张芙蕊 李和平

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

鹿肉作为高蛋白、低脂肪、高矿物质的优质肉类代表受到众多消费者追捧[1]，我国有关鹿的研究大都集中在鹿茸角的再生与生长发育方面，而对鹿肉性能、肉质方面的基础理论研究较为缺乏。目前，许多影响肉质性状的主效基因和候选基因已经成功地在肉用畜禽中发现，并在选种选育、优良品种培育的实践应用中取得了良好效果[2]。开发鹿肉制品已然成为养鹿产业新形势下的新发展战略。

脂肪酸结合蛋白(FABPs)是细胞内脂质结合蛋白(iLBP)家族中的一类同源性较高且可与长链脂肪酸特异性结合的可溶性蛋白质，对动物体内脂肪酸的运输起到关键作用[3]。其在脂质代谢活跃的组织中表达，广泛分布于动物的心肌、肝、肺、皮下脂肪、骨骼肌等多种组织细胞内，对动物肌内脂肪沉积和体内脂肪代谢有重要的调节作用[4]。H-FABP和E-FABP基因是脂肪酸结合蛋白基因家族的重要成员，是评价肉质的重要参考基因。H-FABP，即脂肪酸结合蛋白3，最早发现于小肠黏膜、肝和心脏等组织细胞浆中，能够通过调控脂肪酸的转运和沉积，进而增加机内脂肪含量，改善肌肉嫩度[5]。Shang et al.[6]研究发现，藏猪体内肌内脂肪含量高于大白猪，H-FABP基因在藏猪背最长肌、肝脏等组织中的表达量显著高于大白猪；E-FABP，即脂肪酸结合蛋白5，最初是从牛皮癣相关蛋白中鉴定出，所以也被称为牛皮癣蛋白基因[7]，研究表明E-FABP蛋白在对抗脂质氧化损伤过程中发挥重要作用，能净化脂质过氧化反应的产物，具有类似于消炎药的特性[8]。H-FABP和E-FABP基因被认为是影响肌内脂肪沉积的重要候选基因。

为探索脂肪酸结合蛋白基因在鹿机体不同组织中的表达及其差异，本研究欲以雄、雌性梅花鹿和雌性马鹿为实验动物，以鹿的心、肝、肺、背最长肌、肋间肌、臀大肌、股四头肌和皮下脂肪8种组织样品为试验材料，采用实时荧光定量PCR技术检测H-FABP、E-FABP基因编码蛋白在各组织中的表达量并分析其差异，在分子水平阐明脂肪酸结合蛋白基因在鹿机体不同组织中的表达及其差异，得出鹿不同组织脂肪沉积与代谢规律，并结合前人在牛、羊、猪等家禽家畜中的研究结果予以对比分析，为鹿肉品质研究与鹿肉开发利用提供科学基础参考数据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

于2019年5月在吉林省世鹿鹿业采集4～5岁成年雄性梅花鹿4头、雌性梅花鹿4头、雌性马鹿3头，共11头鹿88份组织样品。按照屠宰规程，鹿只屠宰过程中采集背最长肌、肋间肌、股四头肌、臀大肌、心(乳头肌)、肝(左叶)、肺(右肺上叶)和皮下脂肪8个部位组织，装于冻存管中，置于液氮中-196 ℃保存备用。

1.2 总RNA提取和cDNA的合成

按OMEGA公司总RNA提取试剂盒Total RNA Kit II说明书提取样品总RNA。根据琼脂糖凝胶电泳结果、RNA浓度以及OD值来综合分析所提取RNA的质量和完整性，将提取的总RNA置于冰箱-80 ℃保存。按照PrimeScrip RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒说明书(TaKaRa)对样品总RNA进行反转录合成cDNA第一条链，总反应体系20.0 μL，反应条件为：42 ℃ 2 min、37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，逆转录后的cDNA置于冰箱-20 ℃保存。

1.3 实时荧光定量PCR

1.3.1 引物设计与合成

根据NCBI GenBank数据库中白尾鹿的H-FABP、E-FABP和β-actin内参团基因的序列，利用Primer5.0设计梅花鹿、马鹿的H-FABP、E-FABP基因荧光定量引物，引物信息如表1。

表1 实时荧光定量PCR引物信息

1.3.2 实时荧光定量PCR检测

以上述cDNA为模板，β-actin基因为内参基因，检测H-FABP、E-FABP基因在4头雄性梅花鹿、4头雌性梅花鹿和3头雌性马鹿的背最长肌、肋间肌、股四头肌、臀大肌、心、肝、肺和皮下脂肪组织中的表达量变化。反应体系为20 μL：SYBR Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus)(2×)10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，ROX Reference Dye or Dye II 0.4 μL，灭菌蒸馏水6.0 μL。PCR反应程序：预变性阶段95 ℃ 30 s；40个循环阶段95 ℃ 5 s和60 ℃ 34 s；熔解曲线阶段95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，之后以每0.5 ℃ 10 s的速率从60 ℃上升到95 ℃。每个组织每个基因设置3个重复，以保证数据的准确性。

以β-actin基因为内参基因对H-FABP、E-FABP基因的表达进行相对定量，均以雄性梅花鹿肺组织表达量为1做参照，得出在各组织中的相对表达量，并以此比较其差异。

1.3.3 数据处理与分析

利用ABI 7 500 software软件计算定量所有目的基因和β-actin基因的平均拷贝数，然后用2-ΔΔCt法计算不同基因在不同组织中mRNA的相对表达量。使用SPSS Statistics 24.0软件对荧光定量PCR所得数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取

总RNA提取电泳图的28 S、18 S、5.8 S条带清晰无拖带，且28 S条带亮度接近18 S的2倍。且用移液器吸取1 μL总RNA在超微量分光光度计检测显示，OD260与OD280比值均在1.9～2.0，质量浓度均在800 mg·L-1左右。总之，各组织中的总RNA完整且浓度和纯度合格，可用于后续试验。

2.2 扩增曲线与溶解曲线

H-FABP、E-FABP基因和内参基因β-actin扩增曲线基线平整，拐点清晰，呈S型且指数期明显，符合试验要求；溶解曲线峰值单一且重合性较好，表明引物没有产生非特异性扩增的引物二聚体，引物特异性良好。综上分析，荧光扩增效率良好，扩增产物单一，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(Ct值)可靠，能正确表示3种基因的mRNA表达情况。

H-FABP基因在鹿不同组织中的mRNA相对表达量见表2。H-FABP基因在雄、雌性梅花鹿和雌性马鹿的不同组织中均有表达，不同组织中的表达量存在差异。

表2 H-FABP基因在鹿不同组织中mRNA的相对表达量

雄性梅花鹿H-FABP基因mRNA的表达量由高到低的顺序为：心、股四头肌、背最长肌、臀大肌、肋间肌、皮下脂肪、肺、肝。其中，H-FABP基因在心的mRNA表达量显著高于其他组织(P<0.05)；在肺、肝的表达量显著低于其他组织(P<0.05)，肺、肝之间差异不显著；股四头肌、臀大肌、背最长肌之间差异不显著；背最长肌、肋间肌、臀大肌、皮下脂肪之间差异不显著。雌性梅花鹿H-FABP基因mRNA的表达量由高到低的顺序为：心、臀大肌、肋间肌、股四头肌、背最长肌、皮下脂肪、肺、肝。其中，H-FABP基因在心的mRNA表达量显著高于其他组织(P<0.05)；在肺、肝、皮下脂肪中的表达量显著低于其他组织(P<0.05)，肺、肝、皮下脂肪之间差异不显著(P>0.05)；臀大肌、肋间肌之间差异不显著；肋间肌、背最长肌、股四头肌之间差异不显著。雌性马鹿H-FABP基因mRNA的表达量由高到低的顺序为：心、臀大肌、皮下脂肪、背最长肌、股四头肌、肋间肌、肺、肝。其中，H-FABP基因在心的mRNA表达量显著高于其他组织(P<0.05)；在肝的表达量显著低于其他组织(P<0.05)；臀大肌、皮下脂肪、背最长肌、股四头肌之间差异不显著(P<0.05)；皮下脂肪、背最长肌、股四头肌、肋间肌、肝之间差异不显著；肺、肝之间差异不显著。总体来看，H-FABP基因在心中mRNA表达量最高，其次为肌肉组织，然后为脂肪组织，在肺和肝中表达量最低。

在肺、肝、背最长肌、臀大肌4种组织中，H-FABP基因在雄、雌性梅花鹿、雌性马鹿mRNA的表达量无显著差异；在心中，雄性梅花鹿和雌性梅花鹿的表达量显著高于雌性马鹿(P<0.05)；在肋间肌中，雄性梅花鹿和雌性梅花鹿的表达量显著高于雌性马鹿(P<0.05)；在股四头肌中，雄性梅花鹿的表达量显著高于雌性梅花鹿和雌性马鹿(P<0.05)；在皮下脂肪中，雌性马鹿的表达量显著高于雌性梅花鹿(P<0.05)。

E-FABP基因在鹿不同组织中的mRNA相对表达量见表3。E-FABP基因在雄、雌性梅花鹿和雌性马鹿的不同组织中均有表达，不同组织中的表达量存在差异。

表3 E-FABP基因在鹿不同组织中mRNA的相对表达量

雄性梅花鹿E-FABP基因mRNA的相对表达量由高到低的顺序为：皮下脂肪、股四头肌、背最长肌、肺、臀大肌、肋间肌、心、肝。其中，E-FABP基因在皮下脂肪、股四头肌、背最长肌、肺中mRNA表达量较高且差异显著(P<0.05)；心、肝之间的表达量差异不显著，且心和肝的表达量显著低于其他组织(P<0.05)；臀大肌、肋间肌之间的差异不显著。雌性梅花鹿E-FABP基因mRNA的相对表达量由高到低的顺序为：皮下脂肪、背最长肌、肺、肋间肌、股四头肌、心、臀大肌、肝。其中，E-FABP基因在皮下脂肪中mRNA表达量显著高于其他组织(P<0.05)；在肝、臀大肌的表达量显著低于其他组织(P<0.05)；心、背最长肌之间差异不显著；肺、肋间肌、股四头肌之间差异不显著。雌性马鹿E-FABP基因mRNA的相对表达量由高到低的顺序为：皮下脂肪、肺、股四头肌、背最长肌、肋间肌、心、肝、臀大肌。其中，E-FABP基因在脂肪组织中mRNA的表达量显著高于其他组织(P<0.05)；肝、臀大肌表达量显著低于其他组织(P<0.05)；肺、股四头肌之间差异不显著；肋间肌、心之间差异不显著；心、肝、臀大肌之间差异不显著。总体来看，E-FABP基因在鹿的皮下脂肪组织中mRNA表达量最高，其次为肺、背最长肌、肋间肌、股四头肌和心，在肝和臀大肌中表达量最低。

在肋间肌中，E-FABP基因在雄、雌性梅花鹿、雌性马鹿mRNA的表达量无显著差异；在肺中，雌性马鹿的表达量显著高于雄性梅花鹿、雌性梅花鹿(P<0.05)，雄性梅花鹿的表达量显著高于雌性梅花鹿；在心中，雌性马鹿的表达量显著高于雄、雌性梅花鹿(P<0.05)；在肝中，雌性马鹿的表达量显著高于雄、雌性梅花鹿(P<0.05)；在背最长肌中，雄性梅花鹿的表达量显著高于雌性梅花鹿和雌性马鹿(P<0.05)；雌性马鹿的表达量显著高于雌性梅花鹿；在臀大肌中，雄性梅花鹿的表达量显著高于雌性梅花鹿、雌性马鹿(P<0.05)；在股四头肌中，雄性梅花鹿、雌性马鹿的表达量显著高于雌性梅花鹿；在皮下脂肪中，雄性梅花鹿、雌性马鹿的表达量显著高于雌性梅花鹿。

3 结论与讨论

本研究选取梅花鹿和马鹿的不同组织为试验材料，通过实时荧光定量PCR技术来检测H-FABP、E-FABP基因在鹿不同组织中的表达量，结果显示：H-FABP、E-FABP基因在鹿不同组织中均有表达，且存在显著性差异。H-FABP基因主要分布的组织为心、背最长肌、肋间肌臀大肌和股四头肌。E-FABP基因主要分布的组织为皮下脂肪、肺、背最长肌、肋间肌和股四头肌。H-FABP、E-FABP基因的表达量高低与鹿的性别、种类有关。

H-FABP基因在组织器官的能量供应、脂肪合成过程中作用显著，是影响肌内脂肪沉积的候选基因之一。文力正和乔海云、康康等[9-11]在研究中均发现H-FABP基因的多态性与肌内脂肪含量有显著的相关性。郝称莉等[12]研究发现，不同月龄H-FABP基因在湖羊不同部位表达量有明显差异，且该基因对肌内脂肪沉积有积极作用。由此表明H-FABP基因可以作为选种选育的候选基因。钱成[13]对贵州白山羊H-FABP基因在9个组织中表达量进行分析，结果显示，H-FABP基因在心和股二头肌表达较高，肝脏中表达量最低。乔云海等[10]研究发现H-FABP基因在不同组中均有表达，其中心脏和骨骼肌中表达量较高，其次为肝脏、脾、肾，在肺中表达量最低。本研究结果与上述前人研究结果一致。

李平等[14]研究发现H-FABP基因在放养型宗地花猪背最长肌的表达量显著高于其他组织(P<0.05)，在圈养型宗地花猪腰大肌表达量显著高于其他组织(P<0.05)。本研究结果与该结果不同，分析可能是由于宗地花猪与雌、雄梅花鹿和雌性马鹿的饲养水平、饲养模式不同。赵雪[15]研究H-FABP基因在杜泊羊与小尾寒羊的杂交羊不同组织中的表达量发现，该基因在杂交羊腿部肌肉表达量最高，其次为半腱肌和心，在脾、肾、十二指肠等组织表达量低。本研究结果与该结果不同，分析可能是由于物种差异导致，杂交羊旨在选育优良物种，小尾寒羊高腿，杜泊羊产肉繁殖性能良好，所以二者杂交羊股四头肌的H-FABP基因的表达量高，使肌内脂肪含量变高，肉质更加美味，由此推测H-FABP基因的表达量与肌内脂肪含量呈正相关，具体情况还需实验进一步证明。

E-FABP基因在国内的研究大多集中于医学方面，如代谢综合征、细胞癌变、糖尿病等。Ma[16]在小鼠研究中发现，当A-FABP基因敲除时，E-FABP基因表达上调，对其产生补偿效应，从而使脂肪组织正常发育，保持脂类代谢的稳定，如果缺乏E-FABP基因，在轴突外生长时期，磷脂膜将无法合成必须的脂肪酸基质。由此可见E-FABP基因与动物的生长和脂肪代谢有密切关系。

分析猪转录组[17]的研究发现，E-FABP基因在猪脂肪组织的表达量最高，在肝脏组织中的表达量最低。李宝钧等[18]对绵羊不同组织E-FABP基因的mRNA表达研究发现E-FABP基因在绵羊脂肪组织中表达量最高，在肝脏中表达量最低，显著低于心脏、肌肉组织(P<0.05)。本研究结果与以上结果基本一致，可推断皮下脂肪组织是E-FABP基因的主要表达组织。另一方面E-FABP基因在人、猪、小鼠、绵羊的脂肪组织中均有较高的mRNA表达，由此推测E-FABP基因可能在不同物种的皮下脂肪组织功能一致，具有保守性。

肌内脂肪含量是评价肉质高低的重要指标，H-FABP基因是影响肌内脂肪含量的重要参考基因之一，而E-FABP基因作为一种补偿基因存在，作用同样不可忽视。Gui et al.[19]对409头中国牦牛进行H-FABP基因SNP位点检测研究中发现，H-FABP基因多态性与牦牛体重、体长存在显著相关性。于佳慧[20]采用PCR-SSCP和测序的方法检测京海黄鸡E-FABP基因不同片段的多态性，结果表明P1突变位点基因型对京海黄鸡胫围有极显著影响，P74突变位点基因型对京海黄鸡的腹脂率有极显著影响，对胸肌重有显著影响。以上两人研究结果表明，H-FABP、E-FABP基因的多态性与家畜家禽肉质性状存在相关性。迄今为止，H-FABP基因已被证明可以作为肌内脂肪含量的候选基因，在基因克隆测序和多态性分析等方面研究较为深入，但该基因具体功能及其调控机制尚不明确，还需进一步探究；E-FABP基因在家禽家畜上的研究较少，仅在鸡、鸭等家禽上有研究证明该基因与腹脂率、胸肌重和体尺性状等方面有影响。由此推测，在鹿的育种工作中可将H-FABP、E-FABP基因作为作为肌肉间脂肪的候选基因，这对深入了解鹿体内脂肪组织的生长发育机理、提高鹿肉肌肉间脂肪的含量以及控制多余脂肪沉积有重要意义。通过现代分子检测手段充分探究二者鹿机体内的表达情况，可以有效的改善鹿肉的产品品质，培育优良品种，对改善人们的生活质量具有重要意义。