靶向HDGF-siRNA转染对小鼠结直肠癌肝转移的影响

杨荣娇 廖剑敏

【摘要】 目的：探討肝癌衍生生长因子（HDGF）的小分子干扰RNA（siRNA）对BALB/c小鼠结直肠癌肝转移的影响。方法：选择78只SPF级BALB/c雄性小鼠，应用盲肠造疝原位接种瘤块法建立小鼠结直肠癌肝转移模型。将成功建模的小鼠随机分为3组，即HDGF-siRNA组、NS-siRNA组与生理盐水（NS）组。根据分组情况，分别于肿瘤原位注射HDGF-siRNA、非特异性siRNA（NS-siRNA）及生理盐水，剂量均为0.15 ng/kg，连续治疗30 d。分时间点记录各组小鼠体质量的变化。治疗结束3 d后处死小鼠，肉眼及肝脏切片苏木素-伊红（HE）染色观察各组结直肠癌肝转移情况。结果：治疗5、10、15、20、25和30 d后，HDGF-siRNA组的体质量均明显高于NS-siRNA组与NS组，NS-siRNA组的体质量均明显高于NS组（P<0.05）。HDGF-siRNA组的肝转移结节数明显少于NS-siRNA组及NS组，肝转移率明显低于NS-siRNA组及NS组（P<0.05）。NS-siRNA组的肝转移结节数明显少于NS组（P<0.05），NS-siRNA组与NS组的肝转移率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：HDGF-siRNA可靶向抑制HDGF，从而降低小鼠结直肠癌肝转移的发生，HDGF在结直肠癌肝转移中可能起了重要作用。

【关键词】 肝癌衍生生长因子 小分子干扰RNA 结直肠癌肝转移 HDGF-siRNA BALB/c小鼠

Effect of Targeting HDGF-siRNA Transfection on Liver Metastasis of Colorectal Cancer in Mice/YANG Rongjiao， LIAO Jianmin. //Medical Innovation of China， 2022， 19（02）： 0-031

[Abstract] Objective： To investigate the effect of small interfering RNA （siRNA） of hepatoma-derived growth factor （HDGF） on liver metastasis of colorectal carcinoma in BALB/c mice. Method： A total of 78 SPF BALB/c

male mice were used to establish the model of hepatic metastasis of colorectal cancer. The tumor-bearing mice were randomly divided into three groups， namely HDGF-siRNA group， NS-siRNA group and normal saline （NS） group. According to the grouping， HDGF-siRNA， normal saline nonspecific siRNA （NS-siRNA） and normal saline were injected into the tumor in situ at the dose of 0.15 ng/kg for 30 d. The changes of body weight of each group were recorded at time points. The mice were killed 3 d after treatment. The liver metastasis of colorectal cancer in each group was observed by naked eye and hematoxylin-eosin （HE） staining. Result： After treatment for 5， 10， 15， 20， 25 and 30 d， the body weights of HDGF-siRNA group were significantly higher than those of NS-siRNA group and NS group （P<0.05）. The number of liver metastasis nodules in HDGF-siRNA group was significantly less than those in NS-siRNA group and NS group， and the liver metastasis rate was significantly less than those in NS-siRNA group and NS group （P<0.05）. The number of hepatic metastatic nodules in NS-siRNA group was significantly less than that in NS group （P<0.05）， there was no significant difference in liver metastasis rate between NS-siRNA group and NS group （P>0.05）. Conclusion： HDGF-siRNA can inhibit HDGF and reduce the occurrence of liver metastasis of colorectal cancer in mice， HDGF-siRNA may play an important role in liver metastasis of colorectal cancer.

[Key words] Liver cancer derived growth factor Small interfering RNA Liver metastasis of colorectal cancer HDGF-siRNA BALB/c mice

First-author’s address： The People’s Hospital of Qingyuan City， Guangdong Province， Qingyuan 511518， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.02.007

随着我国人们膳食结构改变及老龄化形势日益加重，结直肠癌的发病率和死亡率越来越高[1]。同时，结直肠癌患者较易发生肝脏侵袭，而肝转移也是结直肠癌患者的主要死亡原因[2-3]。虽然，近年来结直肠癌肝转移临床治疗技术均有较大提升，如手术、放化疗等，但临床效果不太理想，患者预后差[4]。RNA干扰技术是快速高效关闭基因的分子生物学方法，可使目的基因表达被有效阻断。研究显示，肝癌衍生生长因子（HDGF）可通过诱导血管内皮生长因子（VEGF）产生，促进血管生成和肿瘤生长[5-6]，与胃癌、胆囊癌、胰腺癌、食管癌、肾癌、肺癌等多种恶性肿瘤的生长进展相关[7-12]。本研究拟以HDGF为靶点，在体内结直肠癌肝转移动物模型基础上，探讨靶向HDGF-siRNA转染对小鼠结直肠癌肝转移的影响。

1 材料与方法

1.1 基因序列的设计 通过进入National center for biotechnology数据库中，找到HDGF cDNA的全长碱基序列，利用广州道森生物科技有限公司的“siRNA Target Finder and Design Tools”软件设计HDGF-siRNA序列，最终设计出3條针对HDGF-siRNA正反义链序列：（1）siRNA1，CAACAAAUACCAAGUCUUU dTdT，dTdT GUUGUUUAUGGUUCAGAAA;（2）siRNA2，CAAGGAGAAGAACGAGAAA dTdT，dTdT GUUCCUCUUCUUGCUCUUU;（3）siRNA3，CUACCAAGGAAGAUGCUGA dTdT，dTdT GAUGGUUCCUUCUACGACU）。阴性对照siRNA（NS-siRNA）自行设计，以上设计好后均交由广州道森生物科技有限公司合成。

1.2 小鼠结直肠癌肝转移模型的建

1.2.1 实验动物 选择78只SPF级BALB/c小鼠[购自广东省医学实验动物中心，生产许可编号：SXCK（粤）2018-0002]，周龄为6～8周，均为雄性，体质量为17～22 g。饲养条件：自然采光，温度和为湿度分别调节为18～25 ℃和60%～70%，喂养给予普通饲料和自由饮水。

1.2.2 CT26细胞悬液的制备 将小鼠结肠腺癌细胞（CT26细胞）置于RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清）中，培养条件为5%CO2细胞培养箱和37 ℃，应用0.25%胰蛋白酶消化法对指数生长期的细胞进行处理，并经机械吹打，制成细胞悬液，并离心5 min（转速1 000 r/min），弃去上清液，加入生理盐水配制成浓度为1×106/mL，应用台盼蓝染色法检测细胞活力>95%。

1.2.3 实体瘤的获得 随机抓取2只小鼠，于项背部皮下注射0.4 mL的CT26细胞悬液，10 d后可见有肿块（直径约1 cm）形成，对其进行组织取样，经病理检查确诊为癌组织。

1.2.4 盲肠造疝原位接种瘤块术 对小鼠进行全身麻醉，使用50 mg/mL的舒泰50进行肌肉注射，剂量为0.01 mL/10 g。然后取仰卧位，固定其四肢，对腹部术野使用75%酒精进行消毒，对左下腹皮肤做直径约2 cm的纵向切口，稍微游离切口右侧皮肤及皮下组织，进腹，将盲肠拖出体外，并刮破其拖出段的中央位置的浆膜，再将瘤块（直径约2 mm）置入浆膜刮破处，采取荷包缝合包埋术，再将盲肠拖出段埋回腹腔，并进行腹壁缝合[13-14]。术后小鼠在SPF条件下饲养。

1.3 动物模型分组与治疗 成功建模后，随机将78只小鼠分为3组，各26只，分别为HDGF-siRNA组、NS-siRNA组与NS组，于肿瘤原位分别注射靶向HDGF-siRNA、非特异性siRNA（NS-siRNA）及生理盐水（NS），剂量均为0.15 ng/kg，每周2次，连续治疗30 d。治疗结束3 d后，对小鼠进行CO2吸入法处死。

1.4 观察指标 成功建模后，分别于治疗前及治疗1、5、10、15、20、25、30 d后记录小鼠的体质量。对小鼠进行剖腹手术，摘取肝脏，并称重标记大小。（1）光镜观察：使用10%甲醛对肝脏组织进行固定，石蜡包埋，切片（4 μm），行苏木素-伊红（HE）染色，并行光镜下观察。（2）显微镜观察：取相距为2 mm的肝脏冠状切面组织共5个，以最大冠状切面为中心，并行显微镜下观察，统计肝转移结节数。肝转移结节数=肉眼下计数+显微镜下计数。若同一肝转移结节在不同切面出现应视为1个肝转移结节。以肉眼及显微镜下未见转移结节的视为无肝转移发生，反之出现肝转移，比较各组转移率。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0软件，计量数据以（x±s）表示，三组间比较行F检验，计数数据以率（%）表示，比较行字2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肝转移模型小鼠体质量变化比较 治疗前和治疗1 d后，三组体质量比较，差异无统计学意义（P>0.05）;治疗5、10、15、20、25和30 d后，HDGF-siRNA组的体质量均明显高于NS-siRNA组与NS组，NS-siRNA组的体质量均明显高于NS组（P<0.05）。见表1。

2.2 肉眼观察各组小鼠结直肠癌肝转移情况 肉眼观察，HDGF-siRNA组可见肝脏质软，呈红褐色，形态相对正常，表面光滑，可见少量转移结节，NS-siRNA组和NS组均可见肝脏解剖结构异常，呈暗红色，表面可见较多转移结节。见图1、2、3。HDGF-siRNA组、NS-siRNA组和NS组肝转移结节数分别为（1.67±0.52）、（4.17±0.98）、（10.50±1.28）个，HDGF-siRNA组肝转移结节数明显少于NS-siRNA组及NS组（P<0.05），而NS-siRNA组肝转移结节数明显少于NS组（P<0.05）。

2.3 肝脏切片HE染色观察各组结直肠癌肝转移情况 肝脏组织切片在光镜下可见肿瘤细胞呈现巢状聚集，异型性大，分化程度差，并且发生细胞核固缩、核碎裂及小片状坏死，则为肝转移。在光镜下，HDGF-siRNA组有2例发生肝转移，肝转移率为7.69%。见图4。NS-siRNA组有14例发生肝转移，肝转移率为53.85%。見图5。NS组有19例发生肝转移，肝转移率为73.08%。见图6。HDGF-siRNA组的肝转移率明显低于NS-siRNA组及NS组（字2=13.000、23.084，P<0.05），NS-siRNA组的结直肠癌肝转移率与NS组比较，差异无统计学意义（字2=2.073，P>0.05）。

3 讨论

结直肠癌为临床上常见的一种消化系统恶性肿瘤，呈逐年上升趋势。2015年我国结直肠癌新发病例数为38.8万人，在全部恶性肿瘤中位居第3位[4];结直肠癌死亡患者18.7万人，死亡率居第5位[3]。因早期结直肠癌缺乏典型临床症状，绝大多数患者诊断时已处于中晚期，且已出现转移，其中最常见的为肝转移。

HDGF为肝癌衍生生长因子，近年来大量研究证实其在多种肿瘤组织中表达上调，并参与基因转录调控、细胞凋亡、生长、分化和迁移等生物学过程，与肿瘤复发及转移的临床病理学特征显著相关。文献[15-16]研究发现，HDGF-siRNA不仅有效阻断HDGF在结直肠癌lovo细胞的表达，而且明显抑制其增殖，从而在体外可有效诱导结直肠癌细胞凋亡。刘展等[17]研究发现，慢病毒RNAi载体可使HDGF表达明显下调，有效抑制体外结直肠癌细胞增殖。周南翔[18]和周艳艳等[19]研究显示，HDGF在肝癌组织和HepG2细胞中高表达，是肝癌独立的预后预测因子，而siRNA可对其表达进行靶向抑制，从而影响肝癌细胞功能、增殖和侵袭力，而HDGF可能会成为良好的结直肠癌基因治疗分子靶点。郭忠聪等[20]研究显示，抗癌防移片可能通过抑制结直肠癌肝转移模型BALB/c小鼠HDGF和血管内皮生长因子表达，抑制血管新生，从而抑制结直肠癌肝转移。

本研究结果发现，治疗1 d后，三组小鼠萎靡少动，进食和饮水量减少，体质量均有下降，考虑为麻醉及手术刺激所致。治疗5 d后，HDGF-siRNA组小鼠体质量恢复至术前，至第30天取材前体质量较治疗前稍有增加。NS-siRNA组小鼠体质量在治疗20 d后渐恢复至治疗前。NS组小鼠体质量仍呈进行性下降。治疗5、10、15、20、25和30 d后，HDGF-siRNA组的体质量均明显高于NS-siRNA组与NS组，NS-siRNA组的体质量明显高于NS组（P<0.05）。且HDGF-siRNA组的肝转移结节数均明显少于NS-siRNA组及NS组，肝转移率明显低于NS-siRNA组及NS组，NS-siRNA组的肝转移结节数明显少于NS组（P<;0.05）。

综上所述，HDGF-siRNA靶向抑制HDGF可降低小鼠结直肠癌肝转移的发生，HDGF在肿瘤转移中可能起了重要作用。本研究结果可能会为治疗结直肠癌肝转移提供一个新的思路和方法，有望以HDGF为靶点开发新药物用于结直肠癌肝转移的防治。

参考文献

[1] BERIAN J R，AMANDA C，FRANCESCATTI A B，et al.

Correction to：A systematic review of patient perspectives on surveillance after colorectal cancer treatment[J].Journal of Cancer Survivorship，2018，67（6）：320-324.

[2] JAIN S，SACCHI M，VRACHNOS P，et al.Recent advances in the treatment of colorectal liver metastases[J].Hepato-gastroenterology，2005，52（65）：1567-1584.

[3]中华医学会外科分会胃肠外科学组，中华医学会外科分会结直肠外科学组，中国抗癌协会结直肠癌专业委员会，等.中国结直肠癌肝转移诊断和综合治疗指南（Ⅴ2018）[J/OL].中华结直肠疾病电子杂志，2018，7（4）：302-314.

[4]中华医学会外科学分会胃肠外科学组，中华医学会外科学分会结直肠外科学组，中国抗癌协会结直肠癌专业委员会，等.中国结直肠癌肝转移诊断和综合治疗指南（2018版）[J].中国实用外科杂志，2018，38（7）：707-718.

[5] HAMASHIMA C， GOTO R.Potential capacity of endoscopic screening for gastric cancer in Japan[J].Cancer Science，2017，108（1）：101-107.

[6] VNNEN H，VAUHKONEN M，HELSKE T，et al.Non-endoscopic diagnosis of atrophic gastritis with a blood test. Correlation between gastric histology and serum levels of gastrin-17 and pepsinogen Ⅰ： a multicentre study[J].European Journal of Gastroenterology & Hepatology，2003，15（8）：885-891.

[7]周强，何庆.HDGF和VEGF在胃癌组织中的表达及其与肿瘤血管生成的关系[J].中国医药指南，2013（12）：67-70.

[8] LI M L，SHEN J，WU X S，et al.Downregulated expression of hepatoma-derived growth factor （HDGF） reduces gallblad der cancer cell proliferation and invasion[J].Medical Onc ology，2013，30（2）：587-593.

[9] UYAMA H，TOMITA Y，NAKAMURA H，et al.Hepatoma-Derived Growth Factor is a novel prognostic factor for patients with pancreatic cancer[J].Gastroenterology，2006，12（20）：6043-6048.

[10]楊进，马水根，徐朝军，等.食管鳞状细胞癌中HDGF、VEGF表达与微血管形成的关系[J].现代生物医学进展，2014，14（30）：5956-5959.

[11] SHARMA S G，AGGARWAL N，GUPTA S D，et al.

Angiogenesis in renal cell carcinoma： correlation of microvessel densityAnd microvessel area with other prognostic factors[J].International Urology & Nephrology，2011，43（1）：125-129.

[12] ZHANG J，CHEN N，QI J，et al.HDGF and ADAM9 are novel molecular staging biomarkers， prognostic biomarkers and predictive biomarkers for a djuvantchemo therapy in surgically resected stage Ⅰ non-small cell lung cancer[J].Journal of Cancer Research & Clinical Oncology，2014，140（8）：1441-1449.

[13]杨荣娇，王丽京，臧林泉，等.靶向巨噬细胞移动抑制因子的siRNA对小鼠结直肠癌肝转移的影响[J].中华实验外科杂志，2011，28（9）：1495-1497.

[14]甘伙烨，何兴祥，邹湘才，等.盲肠造疝原位接种瘤块法建立小鼠结直肠癌肝转移模型[J].广东医学，2007，28（6）：855-857.

[15]廖斐，董卫国，罗和生，等.沉默肝癌衍生生长因子对结直肠癌细胞增殖的抑制[J].世界华人消化杂志，2009，17（13）：1286-1291.

[16]廖斐，马静静，田山，等.特异性siRNA体外抑制 HDGF基因对人结直肠癌细胞凋亡的影响[J].医学分子生物学杂志，2016，13（5）：258-262，275.

[17]刘展，周会新，杨瑜明，等.siRNA靶向 HDGF抑制结直肠癌细胞SW480的生长[J].中国现代医学杂志，2009，19（9）：1322-1326.

[18]周南翔.SiRNA靶向抑制HDGF表达对肝癌HepG2细胞功能的影响[D].长沙：中南大学，2010：1-85.

[19]周艳艳，周南翔，霍继荣.siRNA靶向抑制HDGF基因对人肝癌细胞株增殖和侵袭力的影响[J].胃肠病学，2009，14（10）：585-588.

[20]郭忠聪，龚纯，文枝，等.抗癌防移片对BALB/c小鼠结直肠癌肝转移HGF、VEGF蛋白表达的影响[J].江西中医药大学学报，2020，32（2）：87-90.

（收稿日期：2021-11-25） （本文编辑：占汇娟）