连续重复超数排卵、冲胚对引进品种肉羊快速扩繁的效果研究

岳永莉，包花拉，莫德日乐吐，李雪玲，王建国

（1.内蒙古大学/省部共建草食家畜生殖调控与繁育国家重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010070；2.内蒙古乐科生物技术有限公司，内蒙古 呼和浩特 010020）

内蒙古地区的肉羊生产处于全国领先水平，2020 年肉羊存栏量、产肉量均位列全国之首。 内蒙古地区的肉羊绝大多数具有蒙古羊血统，在不同的地理环境中逐渐形成了各具特色的乌珠穆沁羊、苏尼特羊、乌冉克羊等优质肉羊品种，21 世纪初将引进品种与当地蒙古羊杂交分别育成了巴美肉羊和昭乌达肉羊［1-2］。为了加快利用引进品种改良本地品种的生长速度及改善产肉性能等性状，以超数排卵与胚胎移植技术（multiple ovulation and embryo transfer，MOET）为核心的现代生物繁育技术的产业化集成应用是一条高效途径，并已成为良种扩繁和濒危物种保护的有力辅助工具［3-4］。

现代生物繁育技术的基础是超数排卵 （超排），通过对动物注射外源性促性腺激素以收获更多的胚胎。 影响超排的因素分为动物因素和环境因素，动物因素主要包括个体的遗传特性（品种）、年龄、生理状态、营养状况等，环境因素则包括外源性激素（质量、用量、方案）、季节、连续处理的间隔等［5-6］。 例如，大龄母羊的超排反应和胚胎产量显著高于年轻母羊［7-8］。 热暴露和营养不足的双重作用引起母羊胚胎产量下降和大卵泡（无排卵）数量增加等应激反应［9］。 母羊重复超排间隔过短则导致回收总胚数减少［10］。因此，超排供体要选择体况佳、营养状况好、性成熟的母羊，连续超排时要选择适合品种的超排方案、季节、时间间隔，这样才能获得理想的超排效果。

激素方案的优化是改善超排及妊娠结果的重要途径［5，11-12］。 在同期发情处理中，使用“醋酸甲羟孕酮+雌二醇”可以减少卵巢反应和处理结果的不稳定性［13］； 若配以间隔注射2 剂前列腺素（prostaglandin，PG）（间隔12～16 d）后56 h 进行人工输精，则有利于提高母羊的妊娠率［14］。常规的促排卵激素方案以促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone，FSH）递减注射为主，有研究发现在同等FSH 剂量下增加注射次数， 可获得更好的超排效果［15］。 另有报道称为了促进同步排卵和增加排卵率，可以使用促性腺激素释放激素（gonadotropinreleasing hormone，GnRH）+马绒毛膜促性腺激素（equinechorionicgonadotropin，eCG）的激素方案［16-17］。此外，超排处理中使用褪黑激素对胚胎数量、质量和妊娠率也有积极影响［18］。

为了解引进品种肉羊的繁殖特性， 该研究对5 个进口品种母羊进行连续超排冲胚操作， 对比分析品种、 季节、 重复超排次数对胚胎生产的影响， 以期为合理安排生产及科学利用引进品种肉羊提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间及地点

该试验于2016—2018 年在位于内蒙古呼和浩特市托克托县的内蒙古乐科生物技术有限公司下属羊场进行。

1.2 试验材料

1.2.1 试验动物

选取从澳大利亚引进的、 利用冷冻胚胎移植技术生产的纯种母羊1 575 只， 包括澳洲白 （n=230）、白头杜泊（n=228）、黑头杜泊（n=541）、白头萨福克（n=200）、黑头萨福克（n=376）5 个品种。 所选母羊的年龄为1～4 岁，体况健康。种公羊是同品种的15～36 月龄的健康个体。

1.2.2 药品及试剂

孕酮海绵栓以及FSH、 孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）、PG、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）等激素均购自宁波三生生物科技有限公司。 Holding 液购自新西兰ICPbio 公司。

1.3 试验方法

1.3.1同期发情和超排处理

将在母羊阴道放置孕酮海绵栓的当天记为0 d， 从第10 天的19：00 开始每隔12 h 剂量递减注射FSH（总剂量330～450 IU），共计6 次。首次注射75 IU FSH 的同时注射200～300 IU PMSG，然后第5 次注射FSH 的同时撤栓， 并注射0.1 mg PG。至少间隔30 d 再进行下一次同期发情和超排处理。 试验方案见图1。

图1 试验方案

1.3.2 人工授精和冲胚

撤栓24 h 后试情，发情母羊在撤栓36 h 后进行腹腔内窥镜输精， 每只羊的每侧子宫角输精量为1∶5 稀释后的新鲜采集精液0.20～0.25 mL（约含1.5 亿个精子）， 输精同时再静脉注射一针150～280 IU LH。 输精后第6 天手术打开腹腔，选择卵巢上有排卵点的一侧取出子宫角， 于子宫角基部穿透子宫壁送入冲胚管， 注入空气待气囊充盈至紧密贴合子宫内壁后， 用套管针插入子宫角的尖端推注预热的冲卵液PBS（每侧20 mL/次），从冲胚管端回收胚胎于集卵皿的Holding 液中，体视镜下观察胚胎状态并记录胚胎总数、胚胎等级（A 级和B 级为可用胚）和未受精卵的数量。

1.3.3 胚胎冷冻和胚胎移植

大部分优质胚胎参考文献［19］中的方法进行了玻璃化冷冻。另有少部分胚胎进行了鲜胚移植。取同步进行同期发情处理的受体母羊， 手术打开腹腔，观察卵巢上的黄体发育情况，在有黄体一侧的输卵管内放入1～2 枚胚胎， 移植后45～50 d，采用B-型超声波孕检并记录妊娠情况。

1.4 数据统计分析

采用GraghPad Prism 8.0 软件的One-Way ANOVA 方法进行分析，应用Tukey 法进行多重比较，P＜0.05 认为有显著差异。

2 结果与分析

2.1 同期发情和胚胎生产情况

2.1.1 小规模同期发情处理情况

2016 年统计的同期发情结果显示 （见表1），春季母羊发情率为92.5%（124 只/134 只），秋季母羊发情率为94.9%（129 只/136 只），证明同期发情方案可以用于繁殖季节和非繁殖季节的超排处理。

表1 小规模同期发情处理结果

2.1.2 小规模重复超排冲胚的可用胚回收情况

在前期小规模重复超排冲胚试验中，20 只同期发情处理后的供体有17 只对超排处理有反应。由表2 可知，在间隔30 d 的2 次重复超排冲胚试验中， 初次处理平均每只羊获得9.6 枚可用胚（164 枚/17 只）， 第2 次处理后获得5.7 枚可用胚（97 枚/17 只），合计收获15.3 枚可用胚（261 枚/17只）。 该结果证明间隔30 d 的重复超排冲胚试验方案可行。

表2 小规模重复超排冲胚的可用胚回收结果

2.1.3 大规模重复超排冲胚试验总体情况

随后开展了大规模连续超排冲胚试验，主要集中于2017 年（从1 320 只母羊上获得可用胚10 720 枚）。 在整个试验期内，该研究从5 个品种共1 575 只母羊回收18 496 枚胚胎，其中，14 971枚胚胎是质量属A 级或B 级的可用胚（见表3）。

有720 只母羊（45.7%）由于生理条件或手术后粘连等原因只进行了1 次超排处理， 共获得3 905 枚胚胎，包含3 129 枚可用胚，占可用胚总数的20.9%；有838 只母羊（53.2%）进行了2～5 次超排，共获得13 894 枚胚胎，包含11 276 枚可用胚， 占可用胚总数的75.3%； 另外17 只母羊（1.1%）进行了6～7 次超排，共获得697 枚胚胎，包含566 枚可用胚，占可用胚总数的3.8%。

有1 只白头萨福克羊和1 只黑头萨福克羊进行了多达7 次的超排处理，共获得107 枚胚胎，包含91 枚可用胚。 最高纪录是1 只黑头萨福克羊，进行了5 次超排，获得83 枚胚胎，包含81 枚可用胚，它也创造了单次排卵纪录——27 枚。

在此超排方案下， 从只均总胚数和只均可用胚数看（见表3），胚胎生产能力的顺序为白头萨福克［只均总胚数为6.1 枚/（只·次），只均可用胚数为5.1 枚/（只·次）］＞黑头萨福克［只均总胚数为5.9 枚/（只·次），只均可用胚数为4.8 枚/（只·次）］＞黑头杜泊［只均总胚数为5.8 枚/（只·次），只均可用胚数为4.5 枚/（只·次）］＞澳洲白［只均总胚数为5.2 枚/（只·次），只均可用胚数为4.3 枚/（只·次）］＞白头杜泊［只均总胚数为4.6 枚/（只·次），只均可用胚数为3.7 枚/（只·次）］。 白头杜泊的只均总胚数显著（P＜0.05）低于其他4 个品种，白头萨福克和黑头萨福克的只均总胚数显著（P＜0.05）高于澳洲白；白头杜泊的只均可用胚数显著（P＜0.05）低于白头萨福克、黑头萨福克、黑头杜泊，白头萨福克的只均可用胚数显著（P＜0.05）高于澳洲白。

表3 大规模重复超排冲胚试验总体结果（2016—2018 年）

有效超排比例（单次生产胚胎≥5 枚）也显示相同的规律： 白头萨福克 （59.7%）＞黑头萨福克（53.5%）＞黑头杜泊（51.8%）＞澳洲白（47.3%）＞白头杜泊（41.5%）。但是不同品种的平均可用胚数占总胚数的比例为75%～80%， 其中， 澳洲白最高（79.6%），黑头杜泊最低（75.0%）。

2.2 不同品种重复超排冲胚效果比较

从重复超排的只均总胚数和只均可用胚数结果看（见表4）， 除了白头杜泊第2 次超排比第1次超排有一定的下降， 其他品种的前2 次超排结果差异不大。之后随着超排次数的增加，每个品种的只均总胚数和只均可用胚数持续上升， 除了白头杜泊因为样本量的关系以上2 个指标只持续上升至第4 次处理， 其他品种的数据均持续上升至第5 次处理后。 超排5 次以上则由于样本量的减少导致数据变异性增大。

表4 不同品种的重复超排冲胚结果（2016—2018 年）

从品种间差异看，在第1 次超排处理中，白头萨福克和黑头杜泊的只均总胚数显著（P＜0.05）高于白头杜泊，5 个品种的只均可用胚数无显著（P＞0.05）差异；在第2 次超排处理中，黑头杜泊、白头萨福克、黑头萨福克的只均总胚数显著（P＜0.05）高于白头杜泊， 白头萨福克和黑头萨福克的只均可用胚数显著（P＜0.05）高于白头杜泊；第3～5 次超排处理中，5 个品种的只均总胚数和只均可用胚数均无显著（P＞0.05）差异。

2.3 季节对不同品种超排冲胚的影响

按照胚胎回收时的月份记录分析不同季节的超排冲胚结果（见表5、表6）。澳洲白在春季（2—4月）表现出最好的超排冲胚效果，在春季的只均总胚数和只均可用胚数均高于夏季（P＞0.05）、秋季（P＜0.05）、冬季（P＞0.05）；3 月的超排冲胚效果最好，只均总胚数为6.2 枚/（只·次），只均可用胚数为5.1 枚/（只·次）。

表5 不同季节的胚胎回收情况（2016—2018 年）

表6 不同月份的胚胎回收情况（2016—2018 年）

其余4 个品种总体上均表现出冬季（11 月至次年1 月）的超排冲胚效果最好，但是品种间有差异。 白头杜泊冬季的只均总胚数和只均可用胚数均高于春季（P＞0.05）、夏季（P＜0.05）、秋季（P＜0.05）；11 月和12 月的超排冲胚效果最好，二者的只均总胚数和只均可用胚数基本相同。 黑头杜泊在冬季的只均总胚数高于春季（P＞0.05）、夏季（P＞0.05）、秋季（P＜0.05），只均可用胚数高于夏季（P＞0.05）、秋季（P＜0.05）；12 月的超排冲胚效果最好。白头萨福克在冬季的只均总胚数高于春季 （P＞0.05）、夏季（P＞0.05）、秋季（P＜0.05），只均可用胚数也高于春季（P＜0.05）、夏季（P＞0.05）、秋季（P＜0.05）；1 月的超排冲胚效果最好， 只均总胚数为7.5 枚/（只·次），只均可用胚数为6.9 枚/（只·次）。黑头萨福克冬季的只均总胚数高于春季 （P＜0.05）、夏季（P＞0.05）、秋季（P＜0.05），只均可用胚数也高于春季（P＜0.05）、夏季（P＜0.05）、秋季（P＜0.05）；12 月的超排冲胚效果最好， 只均总胚数为8.7 枚/（只·次），只均可用胚数为7.6 枚/（只·次）。

白头杜泊在夏季（主要是5 月）进行超排处理后胚胎回收的情况虽然最差，但是样本量较小（15只），除5 月外胚胎回收情况较差的是9 月。 其余4 个品种均表现出秋季的超排冲胚效果最差：澳洲白、 黑头杜泊和黑头萨福克的只均总胚数和只均可用胚数在9 月均为最低值， 白头萨福克则是10 月最低。

2.4 胚胎冷冻和胚胎移植结果

2016—2018 年回收的14 971 枚可用胚胎，先后冷冻11 048 枚。 另有3 923 枚胚胎移植到同期发情处理后的受体母羊，B-型超声波孕检显示有2 737 只怀孕， 受胎率为69.8%（2 737 只/3 923枚），怀孕到期产羔2 552 只，产羔率93.2%（2 552只/2 737 只）（见表7）。

表7 胚胎移植及受胎、产羔结果

3 讨论

在肉羊品种改良领域，MOET 技术是高效生产优质羔羊的最佳选择， 同时可以实现对母羊遗传资源最大限度的利用。 该研究是对MOET 技术的连续超排冲胚处理产业化应用的初步尝试。 国内外连续超排冲胚处理绝大多数在3 次以内，而该研究多达7 次的连续超排冲胚处理尚属首次报道。该研究于2016—2018 年选用5 个进口品种纯种肉羊作为供体， 从1 575 只母羊回收14 971 枚可用胚胎， 其中，2017 年共处理1 320 只母羊，获得10 720 枚可用胚胎。 根据受胎率（69.8%）和产羔率（93.2%），预测1 只母羊1 年内经过超排冲胚与胚胎移植可获得5 只羊羔， 充分验证了MOET技术产业化应用的可观经济效益。

超排是MOET 技术产业化应用的重要影响因素， 而品种的繁殖特性是影响超排效果的主要内因。 在该研究制定的超排方案下，5 个品种的胚胎生产性能比较结果显示， 白头萨福克、 黑头萨福克、黑头杜泊的繁殖性能较好，澳洲白次之，白头杜泊最差。研究显示，萨福克羊的这两个品种的超排冲胚性能是较优的。张秀陶等［20］研究表明，与道赛特和特克赛尔羊相比， 白头萨福克超排后的黄体数和可用胚数是最高的。郭延华等［21］研究表明，黑头萨福克和白头萨福克的胚胎生产能力优于白头杜泊和道赛特。 此外，Bergstein-Galan 等［22］的研究证明黑头杜泊的超排冲胚效果优于白头杜泊。上述研究与该研究均显示白头杜泊胚胎生产能力最差，与该品种继承了美利奴的基因残余有关［23］。

连续重复超排冲胚是繁育技术产业化集成应用提高肉羊养殖效益的关键。该研究结果提示，连续重复超排冲胚过程中只要保证供体羊的规模，每只羊每次处理后回收的只均总胚数和可用胚数能够持续增长，至少可以增长到第4 次处理之后。因此， 推断有部分母羊在多次超排冲胚处理过程中，排卵数和胚胎数是增加的。已报道的重复超排研究由于肉羊品种、试验设计、样本量等的差异所得结论有所不同。张果平等［24］对17 只杜泊羊连续3 次超排处理的结果显示总胚数和可用胚数逐渐递减。 祖尔东·热合曼等［25］对10 只萨福克羊进行间隔1 年的重复超排处理， 平均排卵率虽无显著差异， 但第3 年的可用胚数量显著低于前两次。Bruno-Galarraga 等［10］报道了对10 只美利奴肉羊的连续3 次超排结果， 回收的总胚数和可用胚数也都呈现下降趋势。 但是，吴姣等［26］将30 只小尾寒羊根据首次超排后的黄体状态调整后续超排的FSH 注射方案，有12 只黄体状态正常的母羊连续3 次超排回收的卵子数量无显著差异。 张良［27］统计了77 只不同品种的羊进行2 次超排的结果，第2 次超排的效果好于第1 次。 张帆等［28］对经产的30 只黑头杜泊羊间隔1 年重复超排的试验结果显示，第2 次效果略好于第1 次，同时，强调了手术时尽量减少出血点、 适当灌注含林可霉素的生理盐水避免粘连， 羊只重复超排的效果是可以得到保证的。上述研究与该研究提示，虽然有些母羊由于个体、 术后粘连等原因影响了连续超排冲胚的效果，但当供体羊群体达到一定规模时（如20只以上），还是能够保证重复超排冲胚效果。

重复超排冲胚还受到激素质量、术后粘连、供体年龄等因素的影响。 目前国内普遍采用性价比较高的国产激素替代进口激素［29］，该研究也采用了国产激素，效果是比较稳定的。尹启宝等［30］连续4 年每年对同一群萨福克母羊进行超排处理，使用国产激素的第3 年较前两年效果显著下降，认为是产生了激素免疫而影响了超排效果， 第4 年换用进口激素后效果恢复。 朱芳贤等［31］对兰州大尾羊分别间隔2 个月和4 个月连续进行3 次超排，发现随着超排次数的增加，母羊发生术后粘连的比例增加，粘连程度也加重，从而造成可用胚数显著下降。 傅文栋等［32］证明大龄（7～9 岁）萨福克羊进行连续3 次超排回收的总胚数和可用胚数均逐渐下降。

地形地貌、 光照和气温等自然环境条件对母羊的生殖内分泌造成一定影响，超排的月份/季节对不同地区、不同品种母羊的影响也有差异。该研究结果显示，除澳洲白以外，其他品种的超排效果均表现为冬季较好、秋季较差，因此，可根据每个品种超排效果较好的月份提前安排同期发情与超排处理，而且最好避开8 月与9 月初处理。笔者所在研究团队在内蒙古四子王旗开展试验获得的黑头杜泊羊超排冲胚数据也显示10—12 月的效果显著优于4—6 月［33］。在新疆阿克苏地区开展的萨福克羊超排试验结果显示，9 月中旬至10 月中旬的效果好于前后2 个月［25］。 在新疆哈密地区开展的萨福克羊超排试验结果显示，12 月的效果好于4 月［34］。 黑头萨福克羊在甘肃陇东地区的超排处理效果在9 月比3 月更好［35］。在该研究中，秋季超排效果较差的原因可能是处于繁殖期的卵巢在激素处理前就已存在大卵泡， 抑制了母羊对外源FSH 的反应［36］。

超排效果不稳定始终是阻碍其产业化应用的瓶颈问题。排除术后粘连或者卵巢过大、伞部硬化等情况，在相同超排条件下，群体中仍有部分母羊对超排处理无反应、不排卵，这很可能与个体遗传差异或个体对激素刺激的敏感性差异有关。 研究显示体重因素和包括HOX 基因家族在内的11 个基因对萨福克羊的超排结果存在影响［6，37］。 此外，该研究中还有少部分个体出现了在数次成功超排处理中有1 次无反应的现象。因此，利用技术手段提前预测超排效果是提高其产业化应用效率的发展趋势，例如，通过前一次同期发情处理后卵泡波中的卵泡数量预测下一次的超排反应效果［38］；利用直肠卵巢超声波观察排卵后的黄体数目， 提前评估超排效果，避免不必要的冲胚手术［39］。赵冰茹等［40-41］研究发现，回收胚胎数与超排前1 天外周血血清中的蛋白质浓度呈负相关， 与FSH、LH、AMH 激素的浓度呈正相关， 从而推导出回归模型，可对胚胎回收数进行预测评估。利用非手术手段进行预测， 对于提高母羊超排冲胚效果以及提升动物福利水平具有重要意义。

4 结论

大规模母羊连续超排冲胚试验中， 在半数母羊进行了2 次以上超排的情况下，获得了接近10倍于供体数目的可用胚胎， 当供体数量达到一定规模（如20 只以上）时，每只母羊回收的只均总胚数和可用胚数基本保持持续增长趋势。 在供体母羊的营养管理到位、避免术后粘连的情况下，全年连续进行超排冲胚处理是可行的。 该种技术模式有利于提高优质、纯种母羊的利用效率，从而缩短肉羊养殖的资金回报周期。