磷肥下移深度对苜蓿根颈含氮保护物质及其抗寒性的影响

夏全超，张玉霞，孙明雪，陈卫东，孙 昊，张庆昕，丛百明

(1.内蒙古民族大学农学院，内蒙古 通辽 028041；2.内蒙古自治区通辽市畜牧兽医科学研究所，内蒙古 通辽 028000)

苜蓿(MedicagosativaL.)是世界公认的优质高产多年生豆科牧草[1]，具有营养元素全面、蛋白质含量高、家畜喜食、可利用年限长的特点，被誉为“牧草之王”[2-3]，近年来在我国种植面积不断增加，为我国畜牧业发展提供了有力保障。科尔沁地区位于内蒙古东部，该地区四季分明，降水主要集中在夏季，冬季严寒且降水少，并且近年来在初春时期出现了倒春寒现象，严重限制了苜蓿越冬[4]。苜蓿根颈是冬季苜蓿植物体最上部的休眠器官，是对冻害最敏感的部位，与苜蓿的抗寒性、再生性等均有密切关系，因此在苜蓿越冬和春季返青时的发枝萌芽过程中发挥着极其重要的作用[5]。磷元素是植物生长发育必不可少的生命元素，同时也是植物合成磷脂、核酸、ATP等重要物质的主要原料，在植物的光合作用、呼吸作用、脂肪代谢、糖代谢及氮代谢等生理生化过程中起着不可替代的作用[6]。植物细胞膜中的磷脂可与蛋白质、糖类等物质相互作用，缓解低温冷冻引起的细胞脱水，保护生物膜的稳定，在植物抗寒性方面有重大作用[7]。有研究表明磷能提高植物体内可溶性蛋白、脯氨酸、可溶性糖类等物质浓度从而提高植物抗寒能力[8]。土壤中磷的总量大约在0.02%～0.2%[9]，与其他大量元素相比含量较低[10]。虽然土壤中含有一定量的有效磷和无效磷[11-13]，但传统磷肥主要施用在土壤表面，并且磷在土壤中的流动性差又极易被固持，导致植物对土壤中的磷元素利用率很低，进而影响植物的生长及生理代谢[14-15]。但是过量施入磷肥又会造成浪费和环境污染，因此，本研究针对苜蓿栽培生产中磷素与苜蓿根系空间分布匹配性差的问题，探讨不同施磷深度对苜蓿根颈含氮物质及抗寒性的影响，旨在为苜蓿抗寒高产栽培中磷肥的高效管理提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于内蒙古通辽市开鲁县东风镇林辉草业公司基地(121°31′E，43°60′N)，该地区属于温带大陆性半干旱气候，四季分明，夏季炎热多雨，冬季干旱少雪，≥10℃年积温为3 000℃～3 200℃，年平均气温5.8℃，无霜期140～150 d，年平均降水量约370 mm，年平均风速3.1～4.3 m·s-1，土壤有机质含量为64.10 mg·kg-1，碱解氮含量为35.88 mg·kg-1，全氮含量44.01 mg·kg-1，速效磷含量3.59 mg·kg-1，速效钾含量77.89 mg·kg-1。

1.2 试验设计

1.2.1 大田试验设计 供试材料为‘北极熊’紫花苜蓿品种(M.sativa‘Gibraltar’)，由北京百思特有限公司提供。该品种的秋眠级为2.0级，幼苗强壮、根系发达、多叶率高，是抗寒性能非常突出的苜蓿品种。试验采用随机区组设计，于2020年7月1日播种，播种量为22.5 kg·hm-2，行距为30 cm，小区面积为3 m×5 m=15 m2。播种前一次性施入氯化钾(100 kg·hm-2K2O)为基肥。磷肥用量为225 kg·hm-2(P2O5)，共设置5个施磷深度：施土地表面(S0)、距离地表7.5 cm(S1)、15 cm(S2)、22.5 cm(S3)、30 cm(S4)，并设置不施磷肥作为对照(CK)，每个处理设置3次重复，共18个小区，磷肥均作为基肥于播种前一次性施入，施磷方式为开沟条施。试验田灌水使用指针式喷灌，并正常进行田间管理。于封冻前11月15日挖取长势一致的苜蓿根系(越冬器官)，带回室内进行低温处理，取苜蓿根系距离地表0～2 cm部位，测定含氮物质含量和相对电导率。

1.2.2 低温处理 参照朱爱民等[16]的试验方法，每个处理取50株长势均匀一致的苜蓿根颈，平均分成4份，其中1份放入4℃冰箱中储存(低温冷藏)，将另外3份苜蓿根系用蒸馏水冲洗干净，先用20 cm×30 cm的脱脂纯棉布包裹，均匀喷洒3 mL蒸馏水使棉布保持湿润，再用30 cm×30 cm的锡箔纸包裹，放入可程式恒温恒湿试验箱分别进行-10℃、-20℃、-30℃低温处理(低温冷冻)。可程式恒温恒湿试验箱设置为：以4℃为起点，先以4℃·h-1的速率降温，在目标温度下保持6 h，后以4℃·h-1的速度升温至4℃，取出后在4℃下放置12 h，与冷藏处理材料(4℃)同时测定根颈相对电导率、可溶性蛋白、游离氨基酸和脯氨酸含量。

1.3 测定指标及方法

相对电导率(REC)采用DDS电导率仪测定法进行测定[17]，可溶性蛋白(SP)含量采用考马斯亮蓝 G-250 法测定[17]，脯氨酸(Pro)含量采用酸性茚三酮法测定[17]，游离氨基酸(AA)含量采用水合茚三酮法测定[17]。

1.4 数据处理

试验数据采用WPS 2019软件整理数据和绘制图表，用DPS 7.0软件进行方差显著性分析及相关性分析，采用二因素试验统计分析Duncan新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 施磷深度对苜蓿相对电导率的影响

如表1所示，S0处理的苜蓿根颈相对电导率在不同低温胁迫处理下均小于CK，说明施磷能降低苜蓿根颈相对电导率。不同施磷深度处理之间，以S2施磷深度处理的相对电导率在不同低温胁迫处理下均达到最小值，说明该施磷深度最有利于减少细胞液外渗程度，降低细胞膜透性；随着处理温度的降低，苜蓿根颈的相对电导率不断增加，且在-30℃下达到最大值，说明随着低温胁迫处理温度的降低，苜蓿根颈细胞膜透性增加，电解质外渗液增多，细胞膜破坏更严重。

表1 施磷深度对苜蓿根颈相对电导率的影响/%

2.2 施磷深度对苜蓿可溶性蛋白含量的影响

如表2所示，S0处理的苜蓿根颈可溶性蛋白含量在不同低温胁迫处理下均显著高于CK(P<0.05)，在4℃、-10℃、-20℃和-30℃处理下分别较CK增长了33.32%、61.66%、36.11%和37.46%，说明与不施磷相比，施用磷肥能提高苜蓿根颈内的可溶性蛋白含量。不同施磷深度处理之间，S2处理的可溶性蛋白含量在不同低温胁迫处理下均较高，说明S2(距离土壤表面15 cm施磷)处理最有利于苜蓿根颈中可溶性蛋白的积累。3个低温胁迫处理下，随着胁迫温度的降低，苜蓿根颈可溶性蛋白含量也逐渐降低，-10℃低温胁迫处理下的可溶性蛋白含量均显著高于其他温度处理(P<0.05)，说明-10℃低温胁迫处理最有利于增加苜蓿根颈中的可溶性蛋白含量，更有利于维持细胞渗透势。

表2 施磷深度对苜蓿根颈可溶性蛋白含量的影响/(mg·g-1)

2.3 施磷深度对苜蓿脯氨酸含量的影响

如表3所示，S0处理的苜蓿根颈脯氨酸含量在不同低温胁迫处理下均显著高于CK(P<0.05)，在4℃、-10℃、-20℃和-30℃处理下分别较CK增长了75.47%、112.50%、84.29%和172.95%，说明与不施磷相比，施用磷肥能提高苜蓿根颈内的脯氨酸含量。不同施磷深度处理之间，S0、S1和S2处理的脯氨酸含量在不同低温胁迫处理下均较高，说明施表面、距离土表10cm或15 cm，均有利于苜蓿根颈中脯氨酸的积累。且S1、S2和S3施磷深度处理下，-10℃、-20℃和-30℃低温胁迫处理间的苜蓿根颈脯氨酸含量均无显著性差异(P<0.05)。综上说明S1和S2磷肥施用深度处理能促进苜蓿根颈中的脯氨酸积累，且受低温胁迫温度变化的影响较小。

表3 施磷深度对苜蓿根颈脯氨酸含量的影响/(μg·g-1)

2.4 施磷深度对苜蓿游离氨基酸含量的影响

如表4所示，S0处理的苜蓿根颈可溶性蛋白含量在4℃、-10℃、-20℃低温胁迫处理下均显著高于CK(P<0.05)，分别较CK增长了42.03%、16.07%和32.56%，说明与不施磷相比，施用磷肥能提高苜蓿根颈内的游离氨基酸含量。3个低温胁迫处理下，随着胁迫温度的降低，苜蓿根颈游离氨基酸含量也逐渐降低，-10℃处理下的游离氨基酸含量在不同施磷深度处理下均显著高于其他温度处理(P<0.05)，其中S0、S1和S2处理的游离氨基酸含量显著高于S3和S4处理，说明施表面、距离土表10 cm或15 cm均有利于提高苜蓿根颈中游离氨基酸含量。而-30℃低温胁迫处理的游离氨基酸含量显著低于其他低温胁迫处理(P<0.05)，数值接近于0，说明-30℃低温胁迫已导致苜蓿根颈细胞中游离氨基酸无法积累。

表4 施磷深度对苜蓿根颈游离氨基酸含量的影响/(mg·g-1)

2.5 相对电导率与苜蓿根颈中的含氮保护物质相关性分析

如表5所示，4℃处理下，脯氨酸含量与游离氨基酸含量呈极显著正相关(P<0.01)。-10℃低温胁迫处理下，相对电导率与可溶性蛋白呈极显著负相关(P<0.01)，与脯氨酸含量呈显著负相关(P<0.05)；脯氨酸含量与可溶性蛋白含量呈显著正相关(P<0.05)；-20℃低温胁迫处理下，可溶性蛋白与脯氨酸和游离氨基酸含量呈极显著正相关(P<0.01)；脯氨酸含量与游离氨基酸含量呈极显著正相关(P<0.01)；-30℃低温胁迫处理下，相对电导率与可溶性蛋白含量呈极显著负相关(P<0.01)，游离氨基酸含量与可溶性蛋白含量呈显著正相关(P<0.05)，与脯氨酸含量呈极显著正相关(P<0.01)。表明苜蓿根颈可溶性蛋白含量的增加有利于降低相对电导率，而低温胁迫下苜蓿根颈中的含氮保护物质含量相互作用、相互促进增长或转化，提高苜蓿的抗寒性。

表5 相对电导率与苜蓿根颈中含氮保护物质的相关性

3 讨 论

低温胁迫条件下，植物细胞膜受损，膜透性增大，严重时会导致细胞死亡，因此相对电导率可以用作反映植物受伤害程度及植物抗寒能力强弱的指标[18-19]。程嘉惠等[20]的研究结果表明，草莓叶片相对电导率随着胁迫温度下降而上升，与本研究结果一致。并且本研究结果表明，-10℃、-20℃和-30℃ 3个不同低温胁迫处理下，相对电导率均在S2处理(施磷深度为15 cm)时最低，表明根颈在此深度下受伤害程度最低。

可溶性蛋白是植物所有蛋白组分中最活跃的一部分，可溶性蛋白的含量可以反映各种蛋白类调节物质的水平，也能在一定程度上反映出植物体的总代谢情况，是用来衡量植物对逆境胁迫抗性的重要参考指标[21]。本试验研究结果表明，随着胁迫温度的降低，苜蓿根颈可溶性蛋白含量表现为先上升后下降的变化趋势，且在-10℃下达到最大值。杨振亚等[22]的研究结果表明5个雷竹变型可溶性蛋白含量均随温度的降低呈先升高后降低的趋势，与本研究结果一致。本研究结果表明，在S2处理时苜蓿根颈可溶性蛋白含量最高，说明15 cm施磷深度最有利于可溶性蛋白的积累，促进氮素代谢，以维持细胞一定的代谢活性和胁迫抵抗能力。

游离氨基酸是参与蛋白质等含氮化合物合成与分解过程的含氮保护物质，其含量的多少可反映植物体内的氮素代谢情况[23]。脯氨酸既可以作为氮源，又可以作为渗透调节物质，维持细胞渗透势，保护生物大分子结构，调节细胞内pH值[24-26]。本试验研究表明施用磷肥处理的苜蓿根颈脯氨酸含量在不同低温胁迫处理下均显著高于CK(P<0.05)，与王天等[8]的研究结果基本一致。并且本研究中，-10℃处理下的脯氨酸和游离氨基酸含量在不同施磷深度处理下均显著高于4℃温度处理，且均在S0和S2处理下数值最高，说明适当深度增施磷肥有利于低温胁迫下苜蓿根颈中脯氨酸与游离氨基酸的积累；增强细胞保水能力，保护蛋白分子与酶的活性，减轻膜脂过氧化程度，在植物抗寒性方面有着极其重要的作用[27]。

目前实际牧草生产中施用磷肥时，多采用抛施的方式，即施到土壤表面，或在播种时随种子一并施入到距离土表3～5 cm处，因此易发生土壤磷流失多、植物吸收少的问题。但是根据本研究结果显示，距离土壤表面15 cm处施用磷肥最有利于提高苜蓿含氮保护物质含量，此深度下苜蓿根系密集，可最大限度地缩减苜蓿根系与肥料的距离，扩大了苜蓿根系与磷肥的接触面积，磷肥的供需匹配性变好[5]，进而促进较深土层中苜蓿根系与养分接触，提高对磷肥的吸收和利用效率，促进苜蓿越冬器官内脯氨酸、游离氨基酸和可溶性蛋白等含氮保护物质的积累，提高苜蓿抗寒能力。

4 结 论

综上所述，-10℃、-20℃和-30℃ 3个不同低温胁迫处理下，S2(施磷深度为15 cm)处理下苜蓿根颈相对电导率达到最小值，可溶性蛋白含量达到最大值；-10℃处理下的脯氨酸和游离氨基酸含量在不同施磷深度处理下均与4℃处理达到显著性差异(P<0.05)，其中在S0和S2处理下数值最大；综合以上说明距离土壤表面15 cm施用磷肥的S2处理最有利于提高低温胁迫下紫花苜蓿氮代谢关键酶活性和增加其氮积累，降低相对电导率，增强苜蓿抗寒性。因此建议于距离土壤表面15 cm处施用磷肥，促进苜蓿安全越冬。